Titelaufnahme

Titel
Einfluss verschiedener Einfriermedien auf Zahl und Viabilität von menschlichen Leukozyten nach dem Auftauen
Weitere Titel
Influence of Different Freezing Media on the Number and Viability of Human Leukocytes after Thawing
VerfasserKaiser, Kathrin
Erschienen2012
Datum der AbgabeJuli 2012
SpracheDeutsch
DokumenttypBachelorarbeit
Schlagwörter (DE)Stammzelltransplantation / virale Infektionen / adoptive Immuntherapy / ADV-spezifische T Zellen / Kryokonservierung
Schlagwörter (EN)Hematopoietic stem cell transplantation / Viral Infections / adoptive immunotherapy / ADV-specific T cells / Kryopreservation
Zugriffsbeschränkung
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Seit 1959, als die erste hämatopoetische Stammzelltransplantation (HSCT) durchgeführt wurde, hat sich HSCT als eine erfolgreiche Methode, um Patienten, die an malignen und nicht malignen Erkrankung leiden, zu behandeln etabliert. Bei HLA-Inkompatibilität einer HSZT müssen Patienten immunsuppressiv behandelt werden, um das Risiko einer Graft-versus-Host-Krankheit zu reduzieren. Durch diesen immunsuppressiven Status kommt es zu signifikant erhöhter Erkrankungswahrscheinlichkeit und Sterblichkeitsrate aufgrund von viralen Infektionen. Diese werden häufig von Adenovirus (ADV), Cytomegalovirus (CMV) und Epstein-Barr-Virus verursacht. Standard-Therapien mit anti-viralen Mitteln zeigen einzig wirksame Behandlung gegen CMV und EBV, aber nicht gegen ADV und sind giftig, teuer und führen oft zu Übertherapie von Patienten. Kürzlich wurde gezeigt, dass die Immuntherapie eine effektive und viel versprechende Option zur Behandlung von Virusinfektionen ist. Viele Strategien sind zeitaufwendig (4 bis 16 Wochen) und teuer. All diese Einschränkungen behindert eine breitere klinische Anwendung. Daher müssen Zellkulturbedingungen optimiert werden, um in der Lage zu sein, hohe Funktionalität und lebensfähige Virus-spezifischen T-Zellen (CTL) in kurzer Zeit zu erzeugen.

Es wurde gezeigt, dass die Anzahl der langfristigen (4-12 Wochen) in vitro expandierten Virus-spezifischen T-Zellen erhöht werden, wenn eine neue Kulturform mit der Bezeichnung "G-REX" verwendet wurde. G-Rex-Geräte ermöglichen die optimalen Gasaustausch, Nährstoffe und Abfallaufkommen. Darüber hinaus können Arbeitsschritte, wie zum Beispiel Medien-Wechsel oder der Zellteilung und dem Risiko für Verunreinigungen reduziert werden. In der täglichen klinischen Praxis ist der Zeitpunkt der Notwendigkeit von T-Zell-Immuntherapie meist unvorhersehbar. Aus diesem Grund müssen in manchen Fällen T-Zellen prophylaktische erzeugt und kryokonserviert werden, um eine Infusion bei Bedarf zu ermöglichen. Kryokonservierung von Zellen wird mit einem hohen Zellverlust nach dem Auftauen aufgrund von Nekrose und Apoptose. Traditionell verwendete Kryokonservierungs-Lösungen sind "selbst gebraut" und haben eine hohe Dimethylsulfoxid (DMSO)-Konzentration (Endkonzentration 10.6%). DMSO, ein Gefrierschutzmittel, ist notwendig für den Einfrierungsrozess, weil es die Bildung von Eiskristallen, die vielen Zelltypen beschädigen würden, vermeidet. DMSO hat toxische Wirkungen und kann Patienten, die aufgetaute Zellen als Infusion erhalten, schaden. Manchmal werden aufgetaute Zellen gewaschen, um große Mengen an DMSO zu entfernen, jedoch ist dies mit einem hohen Verlust nützlicher Zellen assoziiert.

Die Ziele der Studie waren, ein zuvor in unserem Labor entwickeltes Kurzzeit-Expansions-Protokoll und das Kryokonservierungverfahren zu optimieren.

Wir nutzen das neue G-Rex zur Kultivierung und geprüft, ob ein zusätzlicher Restimulationsschritt mit Monozyten notwendig ist, um den Prozentsatz, die Zellzahl und den Phänotyps von expandierten Zellen, einschließlich ADV-spezifischen T-Zellen, zu erhöhen. Außerdem verglichen wir die Auswirkungen der Verwendung eines konventionellen Einfrieren Medien (EFG) inkl. 10% DMSO (Endkonzentration) mit dem neuen CS10 mit 5% DMSO (Endkonzentration) in Bezug auf die Lebensfähigkeit und die absolute Zellzahl.

Wir konnten zeigen, dass die Restimulation mit Monozyten weder signifikante Veränderung auf den Prozentsatz noch auf die absolute Zahl der expandierten Streptamer + T-Zellen hat. Darüber hinaus gab es auch keine signifikanten Unterschiede zwischen verschiedenen Subpopulationen von CD4 + und CD8 + T-Zellen.

Wir haben gezeigt, dass das neuartige G-Rex hochvitale ADV-spezifische T-Zellen, auch in Abwesenheit von Monozyten zur Restimulation, erzeugt. Deshalb haben wir weiters die Manipulation von expandierten Zellen reduziert, was zu weniger mühsame Arbeit und geringere Kosten führt.

Ähnliche Zunahme von Virus-spezifischen T-Zellen nach der Expansion wurde nur von anderen Grup

Zusammenfassung (Englisch)

Since 1959 when the first Hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) was performed, HSCT has evolved into a common and successful method to treat patients who suffer from malignancies and non-malignant disease. To be able to treat patients, for whom Human Leukocyte Antigens (HLA)-matched donors are not available, also HLA-mismatched HSCT became a new treatment option. However, because of HLA-incompatibility between patients and donors, the risk for graft-versus-host disease is highly increased and could only be reduced by immunosuppressive treatment. Significant morbidity and mortality are results of the immunosuppressive status and are mostly caused by viral infections of Adenovirus (ADV), cytomegalovirus (CMV) and Epstein Barr virus. Standard therapies with antiviral agents show only effective treatment against CMV and EBV but not against ADV and are toxic, expansive and often results in overtreatment of patients. Recently, it was shown that adoptive immunotherapy is an effective and promising option to treat viral infections. Many strategies are limited by time consuming (4 to 16 weeks), expensive and long-term expansion protocols All these major limitations hindered a broader clinical application. Therefore cell culture conditions have to be optimized to be able to generate highly functional and viable virus-specific T-cells (CTL) within a short time frame.

It was shown that the number of long-term (4-12 weeks) in vitro expanded virus-specific T cells could be increased, if a new culture device called “G-REX” was used. G-Rex devices allow optimal gas exchange, nutrients and waste accumulation. Furthermore, working steps, such as media exchanges or cell splitting and the risk for contaminations can be reduced. In the daily clinical practice, the time point and need for T-cell immunotherapy is mostly unpredictable. Therefore in some cases T-cells have to be prophylactic generated and cryopreserved to allow infusion on demand. The procedure is associated with a high cell loss depending on post-thaw necrosis and apoptosis. Traditional used cryopreservation solutions are “home-brewed” and high in their Dimethyl Sulfoxide (DMSO) concentration (final concentration 6-10%). DMSO, a cryoprotectant, is necessary for the freezing processes because it avoids ice crystal formation which would damage many cell types and causes apoptosis. Unfortunately DMSO has toxic effects and is able to harm patients who get thaw cells infused. Sometimes thaw cells were washed to remove high amounts of DMSO but this is associated with a high loss of useful cells.

The aims of the study were to optimize a previously in our laboratory developed short-term expansion protocol and the cryopreservation procedures.

We used the new G-Rex device for culture and tested whether an additional restimulation step with monocytes is necessary to increase the percentage, cell number and phenotype of cultured cells, including ADV-specific T cells. Furthermore, we compared the impact of a conventional used freezing media (EFG) including 10% DMSO (final concentration) with that of the new CS10 including 5% DMSO (final concentration) in terms of viability and absolute cell number. In addition the impact of different cryopreservation media on the function of PBMCs and expanded ADV-specific T cells was tested by ELISpot analysis.

We could demonstrate that the restimulation with monocytes did neither significantly alter the percentage nor the absolute number of expanded Streptamer+ T cells. In addition, there were also no significant differences between different subpopulations of CD4+ and CD8+ T cells.

We showed that the novel G-Rex device is feasible to generate highly viable ADV-specific T cells even in the absence of monocytes used for restimulation. Therefore we have further reduced the manipulation of expanded cells, resulting in less laborious work and lower costs.

Similar increase of virus-specific T cells after expansion was only seen by others, if a ve