Titelaufnahme

Titel
Isolierung und Charakterisierung von Keratinozyten aus Haarwurzeln von gesunden ProbandInnen und PatientInnen mit Atopischer Dermatitis
Weitere Titel
Isolation and characterization of hair follicle derived keratinocytes of healthy probands and patients with Atopic dermatitis
AutorInnenChou, Scharon
GutachterTschandl, Margarete
Erschienen2016
Datum der AbgabeJuni 2016
SpracheDeutsch
DokumenttypBachelorarbeit
Schlagwörter (DE)Atopische Dermatitis / Epidermis / Epidermale Strukturproteine / Haarfollikel-Keratinozyten / Hautbarriere / Keratinozyten-Differenzierung
Schlagwörter (EN)Atopic dermatitis / epidermis / epidermal structural proteins / hair follicle derived keratinocytes / skin barrier / keratinocyte differentiation
Zugriffsbeschränkung
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Einleitung

Die Atopische Dermatitis (AD) ist eine chronisch entzündliche Hauterkrankung, bei der eine defekte Hautbarriere vorliegt. Keratinozyten (KC) sind der Hauptzelltyp der Epidermis und bilden im Zuge ihrer Differenzierung verschiedene Schichten aus. Neben ihrer Funktion der Bildung einer Hautbarriere, spielen KC auch in der Immunabwehr eine wichtige Rolle, da sie Mustererkennungsrezeptoren (Pattern Recognition Receptors, PRRs) exprimieren können. Durch die Stimulierung von Pathogenen können KC Chemokine, Zytokine und antimikrobielle Peptide zur Abwehr freisetzen. Die bei der AD vorherrschende Zytokindysregulation beeinflusst die epidermale Differenzierung und vermindert die Bildung von antimikrobiellen Peptiden. Mit der Anfertigung von organotypischen Hautmodellen aus Haarfollikel-KC von AD ProbandInnen könnte das Verständnis für die Erkrankung verbessert werden. Weiters könnte auch die Frage beantwortet werden, ob die defekte Barrierefunktion von den KC ausgeht.

Methoden

Einzelne Haare wurden freiwilligen ProbandInnen mit AD, Gesunden bzw. AllergikerInnen ausgezupft. In der Zellkultur wurden diese Haare auf eine mit Mitomycin vorbehandelte Fibroblastenkultur gelegt. Sobald einzelne KC Kolonien aus dem Haarfollikel ausgewachsen sind, wurden sie subkultiviert und in weiterer Folge zum Anlegen von organotypischen Hautmodellen verwendet. Die Hautmodelle wurden histologisch aufgearbeitet und Paraffinschnitte angefertigt. Mit denen wurden Hämatoxylin und Eosin (HE) Färbungen und Immunfluoreszenzfärbungen durchgeführt, um die Effekte auf die Keratinozytendifferenzierung zu untersuchen. Dafür wurden die Differenzierungsmarker Filaggrin, Involucrin, Loricrin, Keratin 2, Keratin 5 und Keratin 10 untersucht. Die anschließende quantitative Bestimmung der Expression derselben differenzierungsabhängigen Proteinen erfolgte mittels der Western Blot Analyse.

Ergebnisse

Im Gegensatz zu gesunden ProbandInnen, oder ProbandInnen mit bekannten Allergien sind signifikant weniger KC aus dem Haarfollikel von ProbandInnen mit einer AD ausgewachsen. Diese wuchsen auch deutlich langsamer, sodass keine ausreichende Zellzahl zum Anlegen eines Hautmodells erreicht werden konnte. Die Hautmodelle aus den Haarfollikel-KC von gesunden ProbandInnen bzw. AllergikerInnen wiesen im Vergleich zu jenen, angelegt mit KC von interfollikulärer Epidermis, eine ähnliche KC Differenzierung auf und exprimierten auch die Differenzierungsmarker Filaggrin, Involucrin, Keratin 5 und Keratin 10. Interessanterweise exprimierten die Haarfollikel-KC kein Loricrin und Keratin 2.

Conclusio

In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Haarfollikel-KC eine nicht invasive Quelle von KC darstellen, die es ermöglichen voll differenzierte organotypische Hautmodelle herzustellen. Die Isolierung der Haarfollikel-KC von AD SpenderInnen erwies sich als deutlich schwieriger. Mit verbesserten Isolations- oder Kultivierungsbedingungen könnte es jedoch in Zukunft auch möglich sein, Hautmodelle aus Haarfollikel-KC von ProbandInnen mit AD herzustellen. Diese Modelle könnten bei der Aufklärung der Pathogenese der AD von großem Nutzen sein.

Zusammenfassung (Englisch)

Introduction

Atopic dermatitis (AD) is a chronic inflammatory skin disease with a defective skin barrier function. Keratinocytes (KC) are the main cell type in the epidermis and as part of their epidermal differentiation program they form different layers. KC are not just important for the formation of an intact skin barrier, moreover they are essential for the immune defense. KC express Pattern Recognition Receptors (PRRs) and through stimulation of diverse pathogens, they release chemokines, cytokines and antimicrobial peptides. The dysregulated cytokine profile of the AD has an impact on the epidermal differentiation and leads to a decreased production of antimicrobial peptides. With the organotypic skin model of hair follicle derived KC from patients with AD, we want to investigate if KC from AD patients generate a defective skin barrier also in the absence of cells of the immune system.

Methodes

Hair follicle were plucked from the scalp of volunteers with AD, of healthy volunteers and of allergy sufferer. The KC were cultivated on a mitomycin treated fibroblast feeder layer. After the KC formed colonies around the hair follicle, they were subcultivated and after reaching confluence, they were used to prepare organotypic skin models. Haematoxylin and eosin (HE) staining as well as immunofluorescence stainings were performed. The differentiation markers Filaggrin, Involucrin, Loricrin, Keratin 2, Keratin 5 und Keratin 10 were analyzed. Western Blot analysis was performed to quantify the expression of these proteins.

Results

In contrast to hair follicle KC from healthy donors or patients with allergies, significantly less KC derived from hair follicle of AD patients were isloated. Hair follicle KC from healthy donors or patients with allergies showed a similar epidermal differentiation in the organotypic skin model, as the ones generated with KC from interfollicular epidermis. They expressed the differentitaion associated proteins Filaggrin, Involucrin, Keratin 5 und Keratin 10. Interestingly, KC derived from hair follicle did not express Loricrin and Keratin 2. We were not able to obtain enough KC from donors with AD to generate an in vitro skin model.

Conclusion

In this study we could show that KC derived from hair follicle are a non-invasive source of KC. Hair follicle derived cells showed a similar epidermal differentiation as KC derived from interfollicular epidermis. However the isolation of KC of AD donors turned out to be very difficult, suggesting that improved isolation- and culture conditions are needed. The use of these models could contribute to unraveling processes involved in the pathogenesis of AD.

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