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Title
Expression, Charakterisierung und Anwendung Rekombinanter Proteine bei Studien über Allergische Erkrankungen
Additional Titles
Expression, Characterisation and Application of Recombinant Proteins for Studies of Allergic Diseases
AuthorSchrom, Silke
Published2012
Date of SubmissionJuly 2012
LanguageEnglish
Document typeBachelor Thesis
Keywords (DE)Allergie / Atopische Dermatitis / Rekombinantes Der p 2 (ein Hauptallergen der Hausstaubmilbe) / Antigenitaet / TH2 dominierte Immunantwort in Maeusen
Keywords (EN)Allergy / Atopic dermatitis / Recombinant Der p 2 (one of major allergen of house dust mite) / Antigenicity / TH2 dominated immune response in mice
Restriction-Information
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Classification
Abstract (German)

Expression, Charakterisierung und Anwendung Rekombinanter Proteine bei Studien ueber Allergische Erkrankungen

50% aller Allergiker leiden an Hausstaubmilbenallergie und viele dieser Patienten aeußern ihre Allergie in Form von atopischer Dermatitis. Es ist bekannt, dass Hausstaubmilbenallergie eine entzuendliche Immunantwort ueber die Atemwege ausloesen kann. Das Ziel dieser Arbeit war, herauszufinden, ob durch perkutane Sensibilisierung mit rekombinantem Der p 2, einem Hauptallergen von Hausstaubmilben, ebenfalls eine Immunantwort ausgeloest werden kann. Studien werden bevorzugt mit Hilfe rekombinanter Proteine durchgefuehrt, da die Expression rekombinanter Proteine zu einer reineren Ausbeute fuehrt als die Aufreinigung des Proteins aus seiner natuerlichen Quelle.

rDer p 2 wurde im eukaryotischen Expressionssystem Pichia pastoris exprimiert. Weiters wurde rDer p 2 charakterisiert und an C57BL/6 Maeusen, einem in vivo System fuer atopische Dermatitis, angewandt. Das Allergen rDer p 2 wurde mittels Ni-NTA Aufreinigung, Ammoniumsulfatfaellung, Reinigung von Endotoxinen, Dialyse gegen doppelt destilliertes Wasser und Lyophilisation aufgereinigt. Eine CD Analyse wurde durchgefuehrt, um die Sekundaerstruktur und richtige Faltung von rDer p 2 nachzuweisen. Dazu diente ein CD-Spektrum des natuerlichen Der p 2 publiziert von Tanyaratsrisakul S et al (2010) als Referenz. Um die Proteinkonzentration festzustellen wurde eine BCA Protein Bestimmung und eine SDS-PAGE durchgefuehrt und resultierte in einer Proteinkonzentration von ungefaehr 8,5 mg/ml. Die Antigenitaet von rDer p 2 wurde mittels Western Blot mit Serum von Hausstaubmilbenallergikern getestet. Zur Kontrolle des HIS-tags wurde ein weiterer Blot angefertigt. Bei der erwarteten Groeße von ungefaehr 15 kDA (Molekulargewicht von rDer p 2 mit HIS-tag liegt bei 15,46 kDA) konnte eine Bande detektiert werden. Außerdem wurde ein weiterer Western Blot als negativ-Kontrolle durchgefuehrt, um die Spezifitaet von rDer p 2 zu bestaetigen. Dabei konnten keine unspezifischen Bindungen mit anderen Antikoerpern festgestellt werden.

Nachdem Reinheit, korrekte Struktur und Antigenitaet von rDer p 2 nachgewiesen worden war, konnte rDer p 2 fuer in vivo Studien angewendet werden. Dazu wurden B57BL/6 Maeuse 4 mal in einem Intervall von 3 Wochen mit rDer p 2 perkutan immunisiert. Zwei weitere Gruppen dienten als negativ-Kontrollgruppen. Jede Gruppe bestand aus 8 weiblichen B57BL/6 Maeusen. Eine der negativ-Kontrollgruppen wurde mit PBS behandelt (scheinbehandelt), die andere mit dem nicht-relevanten Kontrollallergen Papain. Blutproben wurden jeweils zwei Wochen nach Sensibilisierung entnommen um den Immunstatus der Maeuse zu beobachten. An den Tagen 84-91 fand die Challenge (gleiches Protokoll wie Sensibilisierung) und 6-9 Stunden spaeter der Sacrifice durch Verwendung von CO2 statt.

Da 80-95% der Hausstaubmilbenallergiker erhoehte Allergen-spezifische IgE und IgG Level aufweisen, wurden Maeuseseren mittels ELISA auf rDer p 2-spezifische IgE, IgG1 und IgG2a Antikoerper getestet. Im Gegensatz dazu weisen nicht-Allergiker zwar IgG Level auf, jedoch keine Allergen-spezifischen IgE Antikoerper. In Maeusen sind hohe IgE- und sehr hohe IgG1 Antikoerpertiter charakteristisch fuer eine allergische Immunantwort.

rDer p 2 immunisierte Maeuse wiesen erhoehte IgE und IgG1 Werte auf. Dies deutet auf eine TH2 vermittelte Immunantwort hin. Die scheinbehandelte- und die mit Papain behandelte Gruppe wiesen keine IgE Werte und nur sehr niedrige IgG1 und IgG2a Werte auf. Diese niedrigen Werte koennten durch Kontamination mit Hausstaubmilben in der Umgebung der Maeuse herstammen.

Alles in einem zeigt diese Arbeit, dass rDer p 2 in der Lage ist, eine allergische Immunantwort ueber die Haut ohne weiteres Adjuvans auszuloesen.

Abstract (English)

Expression, Characterisation and Application of Recombinant Proteins for Studies of Allergic Diseases

50% of all allergic patients suffer from house dust mite allergy and many of these patients display their allergy in form of atopic dermatitis. House dust mite allergy is known to induce an inflammatory immune response via the inhalative route. Therefore the aim of this thesis was to find out, if sensitisation with recombinant Der p 2, a major allergen of house dust mites, via the skin is able to produce an immune response too. Preferably, studies are performed with recombinant proteins, because expression of the recombinant form of proteins lead to a purer yield than purification from the natural source.

rDer p 2 was expressed in an eukaryotic expression system, the yeast strain Pichia pastoris. The next step was to characterise rDer p 2 and to apply in it in vivo in C57BL/6 mice, a mouse-model for atopic dermatitis.

The allergen rDer p 2 was purified by Ni-NTA purification, ammonium sulphate precipitation, protein purification from endotoxins, dialysis against double distilled water and lyophilisation. CD analysis was used to examine secondary structure and correct folding. CD-spectrum of natural Der p 2 published by Tanyaratsrisakul S et al (2010) was used as reference. To determine protein concentration of rDer p 2, a BCA protein assay and SDS-PAGE was performed and resulted in a concentration of about 8.5 mg/ml. Antigenicity of rDer p 2 was tested with serum of house dust mite allergic patients by Western blot. A control blot was performed for HIS-tag detection. A band at the expected size of about 15 kDa (molecular weight of HIS-tagged rDer p 2 is 15.46 kDa) was found. Additionally another Western blot was carried out for negative control to confirm the specificity of rDer p 2. No unspecific binding with other antibodies occurred.

As purity, correct structure and antigenicity of rDer p 2 was proven, this recombinant allergen could be used for in vivo studies. C57BL/6 mice were immunised percutaneously four times in intervals of three weeks with rDer p 2. Two other groups functioned as negative control groups. All groups consisted of 8 female C57BL/6 mice. One of the negative control groups was treated with PBS (sham-treated) and the other group with a non-relevant control allergen papain. Two weeks after each sensitisation blood samples were taken to monitor immune status of the mice. On day 84-91 mice were challenged (same protocol as sensitisations) and sacrificed by CO2-application 6-9 hours later. As 80-95% of patients allergic to house dust mites exhibit increased allergen-specific IgE and IgG levels, mice sera were analysed for rDer p 2-specific IgE, IgG1 and IgG2a by ELISA. In contrast non-allergic patients show levels of IgG, but no allergen-specific IgE antibodies. Formation of high titres of IgE and very high titres of IgG1 are characteristic for an allergic response in the mouse.

rDer p 2 immunised mice exhibited increase IgE and IgG1 titres, which pointed towards a TH2 mediated immune response, while the sham-treated and papain-treated group showed no increased IgE titres and only low basal levels of IgG1 and IgG2a. These low levels may originate from contaminating house dust mite within the environment of the mice.

All in one, the present work shows that rDer p 2 is able to induce an allergic response via the skin without further adjuvants.

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