Titelaufnahme

Titel
Produkton von multigen Vektoren und Synthese von HLA-DR52a-basierenden T-Zell Detektionsreagentien
Weitere Titel
Production of Multigene Vectors and Synthesis of HLA-DR52a-based T-cell Detection Reagents
VerfasserTerlecki-Zaniewicz, Stefan
Erschienen2013
Datum der AbgabeJuli 2013
SpracheEnglisch
DokumenttypBachelorarbeit
Schlagwörter (DE)Immunologie / T-Zellen / HLA-DR52a / HLA-DRA/DRB3*01:01 / cre-Rekombination
Schlagwörter (EN)Immunology / T-cells / HLA-DR52a / HLA-DRA/DRB3*01:01 / cre-recombination
Zugriffsbeschränkung
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Diese Arbeit hatte als Ziel Vektoren zu generieren welche zur Synthese von rekombinanten HLA-DRA/DRB3*01:01 Molekülen verwendet wurden. Der Zweck dieser Proteine war MHC II Tetramere zu produzieren um die in vivo T-Zell Antwort zu untersuchen welche in Relation mit fetaler und neonetaler Alloimmunthrombozytopenie steht. Dies wurde durch Rekombination von drei verschiedenen Vektoren erreicht, wobei jeder ein anderes Insert trägt.

Zuerst wurden die leeren Vektoren mit ihrem bestimmten Insert ligiert. Das Akzeptorplasmid pFL wurde mit DRA/His ligiert, welches für die alpha Kette des MHC II Moleküls und einem nachweisbaren His-Tag kodiert. Die Sequenz der beta Kette, DRB3, wurde in das Spenderplasmid pUCDM integriert. Um effiziente Tetramere zu produzieren muss das rekombinante Protein biotinyliert werden. Hierfür wurde das BirA Enzym, welches von dem Insert BirA in dem Spenderplasmid pSPL kodiert wird, verwendet.

Nach der Rekombination von pFL-DRA/His, pUCMD-DRB3 und pSPL-BirA wurden die Konstrukte mittels einer insertspezifischen PCR und Restriktionsverdauen auf ihre korrekte Konfirmation überprüft.

In den weiteren Schritten wurde der produzierte Trimer in ein Virusgenom integriert welches zur Transfektion von Insektenzellen verwendet wurde. Diese Zellen produzierten das rekombinante HLA-DR52a Molekül welches mittels eines ELISAs nachgewiesen wurde.

Zusammenfassung (Englisch)

This piece of work aimed to generate multigene vectors and synthesize recombinant HLA-DRA/DRB3*01:01 molecules. The goal was to produce MHC II tetramers to study in vivo T-cell responses related to fetal and neonatal alloimmune thrombocytopenia. This was achieved by recombining three different vectors, with each carrying a specific insert.

First the empty vectors were ligated with the desired inserts. The acceptor plasmid pFL was ligated with DRA/His, which codes the alpha chain of the MHC II molecule and a detectable His-tag. The sequence for the beta chain, DRB3, was inserted into the donor plasmid pUCDM. To synthesize an efficient tetramer, the recombinant protein has to be biotinylated. Therefore the BirA enzyme which is coded by the insert BirA in the donor plasmid pSPL was used.

After recombining pFL-DRA/His, pUCDM-DRB3 and pSPL-BirA the constructs were verified by insert-specific PCR sequencing and restriction digests to confirm the correct conformation of the vector.

In further steps the produced trimer was integrated into a virus genome which was used to transfect insect cells. These cells produced the recombinant HLA-DR52a molecule which was confirmed by an ELISA.