Titelaufnahme

Titel
Funktionelle Analyse des PHD-Fingers des Transkriptions-Coaktivators p300
Weitere Titel
Functional Analysis of the PHD Finger in the Transcriptional Coactivator p300
VerfasserEhrhardt, Christine
Erschienen2012
Datum der AbgabeJuli 2012
SpracheEnglisch
DokumenttypBachelorarbeit
Schlagwörter (DE)Acetyltransferasen / CBP / Autoacetylierung / p300 / PHD-Finger / Regulation
Schlagwörter (EN)Acetyltransferases / CBP / Autoacetylation / p300 / PHD finger / Regulation
Zugriffsbeschränkung
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Funktionelle Analyse des PHD-Fingers von dem Transkripions-Coaktivators p300

Der Transkriptions-Coaktivator p300 spielt eine wesentliche Rolle in der Aufrechterhaltung der zellulären Homöostase durch die Acetylierung von Proteinen zur Veränderung der Genexpression oder der Proteinakivität. Es ist daher nicht verwunderlich, dass Deregulation von p300 in Zusammenhang mit verschiedenen menschlichen Krankheiten steht.

Das multidomänen Protein p300 besteht zusätzlich zu der katalytischen Acetlytransferasedomäne aus verschiedenen kleineren Proteinmodulen, welche in zahlreichen Protein-Protein-Interaktionen involviert sind. Zum Beispiel dienen die Bromodomäne und die PHD-Finger Domäne als Erkennungsmodule für acetyliertes Chromatin. Neben verschiedenen posttranslationalen Modifikationen ist Selbstacetylierung eines Loops innerhalb der HAT Domäne eine Art der dynamischen Regulation der p300 Aktivität, welche mit erhöhter katalytischer Aktivität assoziiert ist.

Das Ziel dieses Projektes war die Evaluierung der Theorie, dass der p300 PHD-Finger eine aktivere Rolle durch Regulation der Aktivität der katalytischen Domäne spielen könnte. Diese beruht auf beobachteter Deregulation bei Deletion des PHD-Fingers in p300, welche jedoch massive Auswirkung auf die Struktur der anliegenden katalytischen Domäne haben kann.

Dies wurde mittels einer Punktmutation einer Glutaminsäure an einer bestimmten Position im PHD-Finger durchgeführt, in Anlehnung an eine Mutation im p300 Paralog CBP, welche als katalytisch herunterreguliert beschrieben ist.

Eine bioinformatische Analyse zeigte, dass diese Glutaminsäure innerhalb der p300/CBP Proteinfamilie hochkonserviert ist von Nematoden zu Säugetieren. Zur weiteren Untersuchung dieser konservierten Position wurde die Glutaminsäure in p300 zu Lysin, Arginin, Alanin oder Asparaginsäure mutiert, um molekulare Gründe für mögliche Deregulation bestimmen zu können.

Immunofluoreszenzuntersuchungen zeigten, dass diese p300 Mutanten weiterhin katalytisch aktiv sind aufgrund von Selbstacetylierung und Acetylierung des Transkriptionsfaktors p53. Des Weiteren war die Lokalisation im Zellkern unverändert. Zusätzlich zeigten Westernblot-Analysen, dass diese p300 PHD-Finger Mutanten hochreguliert waren, wobei insbesondere die Mutation zu Lysin eine sehr stark erhöhter Acetylierungsaktivität zeigte.

Dies deutet darauf hin, dass diese Position und damit der p300 PHD-Finger in der Regulation der katalytischen Aktivität von p300 involviert sind. Diese Resultate implizieren, dass die Regulation von p300 durch modifizierte Protein-Protein-Interaktionen mit Deacetylasen oder Acetylasen oder durch veränderte intramolekulare Interaktionen zum Beispiel durch konformelle Reorganisation beeinflusst sein könnte. Mögliche Gründe einer strukturellen Abweichung können veränderte elektrostatische Interaktionen, limitierter Raum für die Seitenkette der Aminosäure oder posttranslationale Modifikationen sein.

Diese könnten in einer Hochregulation der p300 Aktivität über verminderte Inhibition der Autoacetylierung mittels des PHD-Finger, reduzierte Deacetylierung des Loops der katalytischen Domäne durch andere Enzyme oder erhöhte Transacetylierung dieses Aktivierungsloops resultieren.

Ungeachtet dem Punkt, dass die molekularen Gründe für die Deregulation durch die Mutationen nicht vollständig geklärt werden konnten, zeigen die Resultate dieses Projekts die Beteiligung der Glutaminsäure an dieser Position und damit der Domäne PHD-Finger in der Inhibierung der Acetyltransferaseaktivität und weisen auf verschiedene Gründe hin.

Zusammenfassung (Englisch)

Functional analysis of the PHD finger in the transcriptional coactivator p300

The transcriptional coactivator p300 plays a crucial role in maintaining cellular homeosta¬sis by acetylation of proteins to alter gene expression or protein activity. It is therefore not surprising that deregulation of p300 is linked to several severe human diseases.

The multidomain protein p300 contains, in addition to its catalytically histone acetyltransferase (HAT) domain, several smaller protein modules, which are involved in various protein-protein interactions. For example the bromodomain and PHD finger, adjacent to the catalytically domain, can serve as recognition modules for acetylated chromatin. Besides other posttranslational modifications, one means of the dynamic regulation of the p300 activity is autoacetylation of a loop region within the HAT domain, which is linked to increased activity.

The objective of this project was to investigate the theory that the p300 PHD finger could also serve a more active role by regulating the activity of the catalytic domain. This concept was based on deregulation observed by deleting this domain, which could have severe effects on the structure of the catalytic domain.

This was achieved by introducing a point mutation of a glutamic acid at a particular position within the PHD finger. The mutation was constructed homologous to a mutation in the paralogue CBP, which has been described to be catalytically downregu¬lated.

Bioinformatical analysis demonstrated that this glutamic acid is highly conserved in p300/CBP family of proteins from nematodes to mammalian. In order to investigate this conserved position, it was mutated in p300 to either lysine, arginine, alanine or aspartic acid to determine molecular causes for possible deregulation in p300. Immunofluorescence analysis showed that these p300 mutants, locate to the nucleus, are still catalytically active for autoacetylation and acetylation of the transcription factor p53. In addition, Western blot analysis demonstrated that these p300 PHD finger mutants were upregulated. Especially the mutation to lysine showed extensive acetylation activity.

This suggests that this position and thereby the p300 PHD finger is involved in the regulation of the catalytic activity of p300 by inhibition of acetyltransfer¬ase activity. The results implicate that the regulation of p300 could be affected either by altered protein-protein-interactions with deacetylases or acetylases or changed intramolecular interactions for example by conformational rearrangement. There are several possibilities for a structural change such as altered electrostatic interactions, different required space of the amino acid and posttranslational modification. These could result in upregulation of p300 activity via alleviated inhibition of autoacetylation by the PHD finger, reduced deacetylation by other enzymes for downregulation of the HAT loop acetylation or in increased trans acetylation of the activation loop.

Despite the fact that the molecular reason and the outcome for the deregulation by these mutations is not yet fully clear, the results of this project proves the involvement of the glutamic acid at this position and thereby the p300 PHD finger in the inhibition of the acetyltransferase activity and suggest possible causes.