Titelaufnahme

Titel
Bestimmung der Komplement-C3-mRNA-Expression und Protein-Mengen in menschlichen Blutplättchen
Weitere Titel
Determination of Complement C3 mRNA Expression and Protein Levels in Human Platelets
VerfasserKeim, Christoph
Erschienen2012
Datum der AbgabeJuli 2012
SpracheEnglisch
DokumenttypBachelorarbeit
Schlagwörter (DE)complement component C3 / platelets / RNA-isolation / quatitiativ RT-PCR / ELISA
Schlagwörter (EN)Komplementkomponente C3 / Blutplättchen / RNA-Isolierung / quantitative RT-PCR / ELISA
Zugriffsbeschränkung
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Zusammenfassung

Vorausgegangene Ergebnisse, erhalten aus in vitro Experimenten, weisen darauf hin, dass Megakaryocyten das Gen für Komplementkomponente C3 transkribieren. Daher vermuteten wir das Blutplättchen, welche von Megakaryocyten gebildet werden, ebenfalls über RNA für diese Komplementkomponente enthalten beziehungsweise fähig sind dieses Protein zu synthetisieren und abzugeben. Obwohl das Vorhandensein von Komplementkomponenten in einigen Publikationen erwähnt wurde, war man bisher der Meinung, dass Thrombozyten Komplementproteine aus dem Blutplasma absorbieren. Um die Anwesenheit von C3 in Blutplättchen studieren zu können wurden Aliquote von Plättchenkonzentraten, welche am Departement für Bluttransfusion an der Medizinischen Universität in Wien von gesunden Blutplättchenspendern gewonnen wurden, gesammelt. Die Blutplättchen wurden auf das Vorhandensein von C3 mRNA mittels Real-time PCR und von C3-Protein mittels ELISA Assay untersucht. Des Weiteren wurde in einigen Experimenten der Einfluss von, mittels Hitze inaktivierten, E.coli auf Blutplättchen erforscht. Diese Experimente zielten darauf ab den Effekt von Bakterien auf die Translation von Komplementkomponente C3 zu evaluieren.

Da Plättchen nur über eine sehr geringe Menge an mRNA verfügen, war es notwendig die optimale RNA-Extraktionsmethode zu eruieren. Hierfür wurden verschiedene Isolationsmethoden ausprobiert und verglichen. Des Weitern wurden die erhaltenen RNA-Konzentrationen und deren Tauglichkeit für PCR-Amplifikationen ermittelt.

Dieser Vergleich zeigte, dass das auf TRIzol® basierende Protokoll der auf Säulen basierenden RNA-Isolationsmethode von Qiagen klar überlegen ist. Jene RNA-Konzentrationen, die durch die auf TRIzol® basierende Methode gewonnen wurde, wiesen einen 6-28mal höheren Wert auf. Aufgrund dessen entschieden wir uns jene TRIzol® RNA für weitere Analysen mittels Real-time PCR zu nutzen. Die daraus gewonnen Resultate wiesen eine Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit in Bezug auf das von uns verwendete Haushaltsgen auf. Erstaunlicherweise konnten wir die Existenz von C3-mRNA in allen 5 von uns getesteten Plättchenkonzentraten beweisen.

Die Anwesenheit von C3-Protein im Überstand wurde mittels eines ELISA-Assays überprüft.

Da die Herstellerangaben ausschließlich auf das Verdünnen von Plasma- bzw. Serenproben abzielt musste der korrekte Verdünnungsfaktor für unsere Kontroll- und E.coli-Proben evaluiert werden. Wir fanden heraus, dass der Verdünnungsfaktor für Kontrollproben 1:40 und für E.coli-Proben 1:400 beträgt.

Zusammenfassung (Englisch)

Summary

Previously, we obtained results in vitro suggesting that megakaryocytes transcribe the gene for complement component C3. Consequently, we hypothesized that blood platelets, which are generated from megakaryocytes, may also contain RNA for this complement component and may be able to synthesize and release this complement protein. Although the presence of complement components was published in several papers before, up to now it was thought that thrombocytes absorb complement components from the blood plasma. To study the presence of C3 in platelets, we collected aliquots of platelet concentrates prepared at the Department of Blood Transfusion at the Medical University Vienna from healthy platelet donors. The platelets were analysed for the presence of C3 mRNA by Real-time PCR and for C3 protein by ELISA assays. In some experiments we also studied the influence of contact of platelets with heat inactivated E.coli bacteria. These experiments aimed to evaluate an effect of bacteria on C3 translation in blood platelets.

Since platelets contain very low levels of mRNA it was necessary to establish an optimal RNA isolation method. Therefore different RNA isolation methods were used and compared. Furthermore resulting RNA-concentrations and their suitability for PCR amplification were evaluated.

This comparison showed that TRIzol® reagent based protocol was clearly superior to the column-based QIAgen RNA isolation method. RNA concentrations obtained by the TRIzol® method were 6-28 folds higher. We thus decided to use TRIzol® RNA for quantitative Real-time PCR analysis. The results showed reliable and reproducible amplifications of a housekeeping gene. Interestingly, we could demonstrate the presence of mRNA of C3 in 5 different platelet concentrates.

The presence of C3 protein in the culture buffer of platelets was documented by ELISA assays. Since the manufacturer’s protocol only gives advice for the dilutions of human plasma and sera specimen the correct dilution factor for the KO- and E.coli samples had to be evaluated. We found out that the dilution factor used for further experiments was 1:40 for platelet KO-samples and 1:400 for platelet E.coli samples.