Titelaufnahme

Titel
Charakterisierung des Effekts eines kleinen Moleküls zur Hemmung von AKAP abhängigen Protein-Protein Interaktionen auf Kardiomyozyten
Weitere Titel
Characterising the Effects of a Small Molecule to Inhibit AKAP-Dependent Protein-Protein Interactions in Cardiomyocytes
VerfasserWallner, Eva-Sophie
Erschienen2012
Datum der AbgabeJuli 2012
SpracheDeutsch
DokumenttypBachelorarbeit
Schlagwörter (DE)Schlagwoerter: / - kardiale Hypertrophie / - alpha-adrenerger Signaltransduktionsweg / - AKAP-Lbc (A Kinase-Ankerprotein) / - Dbl-Homologie - DH/PH-Domaene / - GEF (Guaninnukleotidaustauschfaktor) fuer GTPase RhoA / - aktiviert ueber G-protein / - reguliert durch Proteinkinase A (PKA) / - von cAMP (zyklisches Adenosinmonophosphat) abhaengig / - Substanz 142 / - blockiert Interaktion von AKAP-Lbc und RhoA / - keine GEF-Aktivitaet / - vermindert kardiale Hypertrophie / - Kandidat fuer Therapieansaetze / - experimentelle Methoden / - Immunopraezipitation / - Gelelektrophorese / - Western Blot / - rekombinantes Protein / - GST-getaggtes AKAP-Lbc und RhoA / - Co-precipitation von RhoA / - bei verschiedenen Substanzkonzentrationen untersucht / - inhibitorischer Effekt nachgewiesen / - funktioniert nicht mit HEK293-Lysaten / - Ueberexpression von AKAP-Lbc und RhoA / - zu wenig AKAP-Lbc Aktivator vorhanden / - Transfektionseffizienz / - keine reproduzierbaren Ergebnisse / - neonatale Kardiomyozyten / - Immunofl
Schlagwörter (EN)Catchwords: / - cardiac Hypertrophy / - alpha-adrenergic signallng pathway / - AKAP-Lbc (A kinase anchoring protein - lymphoid breast cryis) / - Dbl-homology - DH/PH-domain / - GEF (guanin nucleotide exchange factor) for GTPase RhoA / - activated by G-protein / - regulated by proteinkinase A (PKA) / - cAMP (cyclo adenosine monophosphate) dependent / - substance 142 / - blocks interaction of AKAP-Lbc and RhoA / - no GEF-activity / - prevents cardiac hypertrophy / - candidate for therapy / - experimental methods / - immunoprecipitation / - gel electrophoresis / - Western blotting / - recombinant protein / - GST-tagged AKAP-Lbc and RhoA / - co-precipitation of RhoA / - different substance-concentrations of 142 / - inhibitory effect verified / - does not work with HEK293-lysates / - overexpression of AKAP-Lbc and RhoA / - too little AKAP-Lbc activator / - transfection efficiency / - no reproducible interaction detected / - neonatal cardiomyocytes / - immunofluorescence-microscopy / - actinin / - cytoskeleton
Zugriffsbeschränkung
 _
Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Zusammenfassung:

AKAP-Lbc zaehlt zur Familie der A-Kinase-Ankerproteine (AKAPs), deren Hauptaufgabe in der Verankerung der cyclo Adenosinmonophosphat (cAMP) abhaengigen Proteinkinase A (PKA) an spezifische Zellkompartimente besteht. Darueber hinaus verfuegt AKAP-Lbc auch ueber eine spezielle Proteindomaene (DH/PH) mit Guaninnukleotidaustauschfunktion (GEF) fuer die GTPase RhoA. Bei Aktivierung des alpha-adrenergen Signaltransduktionsweges in Kardiomyozyten wird GDP (Guaninnukleotiddiphosphat) durch die GEF-Aktivitaet des AKAP-Lbc gegen GTP (Guaninnukleotidtriphosphat) ausgetauscht. GTP gebundenes RhoA setzt den Signaltransduktionsweg fort und beguenstigt schlussendlich die Auspraegung einer kardialen Hypertrophie.

Neue Experimente mit rekombinanter DH/PH-Domaene und RhoA belegen einerseits, dass die beiden Proteine im Zuge der GEF-Aktivitaet direkt miteinander interagieren und andererseits, dass ein erst kuerzlich entdecktes, kleines chemisches Molekuel (Substanz 142) genau diese Interaktion stoeren und somit die Auspraegung einer Hypertrophie hemmen kann. Dabei kamen molekularbiologische Methoden, wie Immunopraezipitation, Gelelektrophorese und Western Blots zum Einsatz. Ueber Glutathion-S-Transferase (GST) - Beads wurde rekombinante, GST-getaggte DH/PH-DomŠne des AKAP-Lbc praezipitiert und dabei eine Co-Praezipitation der GTPase RhoA herbeigefuehrt. Ab einer Substanzkonzentration von etwa 30 Mikromolar 142 zeigte sich eine deutliche Abnahme der Bandenintensitaet des Co-Praezipitats RhoA. Der hemmende Effekt der Substanz 142 auf die Interaktion von AKAP-Lbc und RhoA konnte somit bewiesen werden.

Dies funktionierte allerdings nur mit rekombinantem Protein. Nach einer Ueberexpression von AKAP-Lbc und RhoA in HEK293-Zellen, konnte die Interaktion zwischen RhoA und AKAP-Lbc nicht reproduzierbar gezeigt werden, da vermutlich durch die Ueberexpression das Gleichgewicht zwischen AKAP-Lbc und dessen Aktivator Galpha12 verschoben wurde und das meiste AKAP-Lbc im inaktiven Zustand blieb.

Bei Immunofluoreszenzmikroskopie-Experimenten mit neonatalen Kardiomyozyten, zeigte Substanz 142 eine besonders ausgepraegte hemmende Wirkung bei beta-adrenerg induzierter Hypertrophie. Dies laesst vermuten, dass es zu Ueberschneiungen zwischen alpha- und beta-adrenergem Signaltransduktionsweg kommt.

Die so erlangten neuen Erkenntnisse liefern einen wichtigen Beitrag zur Charakterisierung des kleinen Molekuels, welches das Potential besitzt, zu einem praeklinischen Kandidaten in der Therapie gegen Herzhypertrophie weiterentwickelt zu werden.

Zusammenfassung (Englisch)

Summary:

AKAP-Lbc is a family member of A-Kinase Anchoring Proteins (AKAPs), whose main function is tethering the cyclic adenosine monophosphate (cAMP) dependent protein kinase (PKA) to certain cell compartments. Moreover, AKAP-Lbc possesses a specific DH/PH-domain that functions as a guanine nucleotide exchange factor (GEF) for the GTPase RhoA. If the alpha-adrenergic signalling pathway becomes activated in cardiomyocytes, the GEF-activity of AKAP-Lbc leads to the exchange of GDP for GTP. GTP-bound RhoA signalls downstream and can ultimately lead to the development of cardiac hypertrophy.

New experiments with recombinant DH/PH-domain and RhoA confirm their linkage through the GEF-activity and indicate, that a recently discovered small molecule (substance 142) is able to interfere with the interaction and consequently inhibits the increase in cardiac hypertrophy markers. The relevant experiments were carried out via molecular-biological methods such as immunoprecipitation, gel electrophoresis and Western blotting. Recombinant GST (Glutathion-S-Transferase)-tagged DH/PH-domain of AKAP-Lbc was precipitated by GST-beads, while the GTPase RhoA became co-precipitated. The addition of 30 micromolar (or more) of substance 142 led to a significant decrease in the co-precipitate. Thus, the inhibitory effect of substance 142 with regard to the interaction between AKAP-Lbc and RhoA was verified. Unfortunately, only experiments with recombinant protein were successful. After overexpression of AKAP-Lbc and RhoA in HEK293-cells, an interaction between AKAP-Lbc and RhoA occurred only very rarely and therefore the results were not reproducible. A reasonable explanation might be, that the equilibrium state between AKAP-Lbc and its activator Galpha12 was disrupted due to the highly overexpressed AKAP-Lbc. Consequently, most of AKAP-Lbc remained in its inactive state.

Furthermore, immunofluorescence-assays indicated a strong inhibitory effect of substance 142 in the case of beta-adrenergic induced hypertrophy in cardiomyocytes. Thus, some crosslinks between the alpha- and beta-adrenergic pathway are very possible.

The new findings provide an important contribution to characterise the effect of the small molecule, which has the potential to be developed to a preclinical candidate for therapies against cardiac hypertrophy.