Bibliographic Metadata

Title
Validierung eines biologischen Assays
Additional Titles
Validation of a biological assay
AuthorLechner, Claudia
Published2012
Date of SubmissionSeptember 2012
LanguageGerman
Document typeBachelor Thesis
Keywords (DE)Japanische Encephalitis Impfstoff / Potency Bestimmung / Plaque Reduktions Neutralisations Test / Effektive Dosis 50 / Vero Zellen
Keywords (EN)Japanese Encephalitis Vaccine / Potency Test / Plaque Reduction Neutralisation Test / Effective Dose 50 / Vero Cells
Restriction-Information
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Classification
Abstract (German)

Validierung eines Biologischen Assays

In dieser Bachelorarbeit wird die Etablierung und Validierung eines Potency Tests zur Chargenfreigabe für den Impfstoff Ixiaro® von Intercell AG, Wien behandelt. Ixiaro® ist ein Impfstoff gegen das Japanische Encephalitis Virus, der auf Zellkulturbasis hergestellt wird und den inaktivierten Virusstamm SA14-14-2 enthält. Der Potency Test umfasst einen in vivo Teil und einen Plaque Reduktions Neutralisations Tests, im weiteren PRNT genannt. Der in vivo Teil wird derzeit bei Charles River Laboratories, Irland durchgeführt und der PRNT bei Intercell Biomedical Ltd, Livingston, wo Ixiaro® auch hergestellt wird. Beide Teile sollen im Rahmen einer Transfervalidierung nach Intercell AG, Wien geholt werden. Der Potency Test beruht auf der Immunisierung von Mäusen mit verschiedenen Dosen von Ixiaro® (in vivo Teil) und der anschließenden Bestimmung der Serokonversionsraten der Mausseren mittels PRNT (PRNT Teil), um die Effektive Dosis 50 (ED50) des Impfstoffes zu ermitteln. Der ED50 gibt an bei welcher Dosis 50% der Mäuse Serokonversion zeigen. Als Serokonverter werden jene Mausseren bezeichnet, die mindestens 50% Plaquereduktion verglichen mit einer Negativkontrolle zeigen.

Im in vivo Teil werden je 10 Mäuse mit 6 verschiedenen Dosen (12,3ng, 37ng, 111ng, 333ng, 1000ng und 3000ng) an Ixiaro® immunisiert. Zusätzlich werden noch 10 Kontrollmäuse mitgeführt, die nicht mit Ixiaro® immunisiert werden. 21 Tage nach der Immunisierung wird das Serum der Mäuse gewonnen. Im PRNT wird dann jedes der 70 Mausseren mit einer definierten Menge Japanische Encephalitis Virus gemischt. Je nach Immunität der Maus wird der Virus inaktiviert. Die Mischung aus Serum und Japanische Encephalitis Virus wird auf Vero Zellen aufgebracht, wo noch aktiver Virus Zellen tötet und dadurch sogenannte Plaques im Zellrasen entstehen. Diese Plaques werden gezählt, um Serokonversionsraten und schließlich mithilfe des Probit Algorithmus einen ED50 zu errechnen.

Beim ersten Versuch wurden in vivo und PRNT Teil kombiniert transferiert. Der PRNT Teil erfüllte die vorgegebenen Akzeptanzkriterien, der in vivo Teil nicht. Daher wurden die verwendeten Methoden entsprechend verbessert. Im in vivo Teil wurde unter anderem die Zeit der Probenhandhabung deutlich verkürzt und die Probleme bei der Immunisierung wurden durch die Einführung einer Injektionsüberprüfung beseitigt. Beim PRNT Teil wurde die Anzahl der aufgrund von Agarose Überschichtungen entstandenen Kontaminationen durch mehrere Maßnahmen deutlich reduziert.

Nach diesen Verbesserungen wurden zwei erneute Transfervalidierungen gestartet, eine für den in vivo Teil, eine für den PRNT Teil. Die Transfervalidierung für den PRNT Teil ist bereits erfolgreich abgeschlossen, während die Tests für den in vivo Teil derzeit noch nicht abgeschlossen sind.

Abstract (English)

VAlidation of a biological assay

This bachelor thesis discusses the establishment and validation of a batch release potency assay for the vaccine Ixiaro® licensed by Intercell AG, Vienna. Ixiaro® is a vaccine preventing against Japanese Encephlitis virus and is manufactured on Vero cells. It contains the inactivated virus strain SA14-14-2. The potency test comprises of an in vivo part and a plaque reduction neutralization test, further referred to as PRNT. The in vivo part is currently performed at Charles River Laboratories, Ireland and PRNT is currently performed at Intercell Biomedical Ltd, Livingston. Ixiaro® is also manufactured at Intercell Biomedical Ltd, Livingston. Both parts of the potency assay shall be transferred and validated to Intercell AG, Vienna. For the potency test mice are immunized with different doses of Ixiaro® (in vivo part) and subsequently seroconversion rates of the mouse sera are determined by PRNT (PRNT part) to finally calculate an effective dose 50 (ED50). The effective dose 50 is the dose of Ixiaro® where 50% of the mice show seroconversion. All mouse sera exhibiting a plaque reduction of a minimum of 50% compared to a negative control are so called seroconverters.

For the in vivo part six different doses of Ixiaro® (12,3ng, 37ng, 111ng, 333ng, 1000ng and 3000ng) are injected into ten mice each. Additionally 10 control mice are run in parallel, which are not immunized with Ixiaro®. 21 days post immunization the serum of the mice is taken. All 70 mouse sera are then analyzed using PRNT. Each serum is mixed with a defined amount of Japanese Encephalitis virus and depending on the immunity of the serum, the virus is inactivated. The mixture containing serum and virus is then put onto Vero cells, susceptible to virus. Active virus kills Vero cells and therefore creates holes in the cell monolayer, so called plaques. The plaques are counted and seroconversion rates are determined using the Probit algorithm.

First, in vivo part and PRNT part were transferred together in one combined transfer validation. The PRNT part met all predefined acceptance criteria, whereas the in vivo part did not. Therefore the methods were improved. In the in vivo part the sample handling time was drastically shortened and problems during i.p. injection of the mice were eliminated using injection tests to confirm the correct route of injection. In the PRNT part contaminations caused by the Agarose overlay could be reduced to a minimum due to several implemented measures.

Following the improvements two new transfer validations were started, one for the in vivo part, one for the PRNT part. The transfer validation for the PRNT part could be completed successfully. The transfer validation for the in vivo part is still ongoing.

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