Titelaufnahme

Titel
Optimierung der Isolierung und Kultivierung von bovinen Fibroblasten und Keratinozyten
Weitere Titel
Optimization of isolation and cultivation of bovine fibroblasts and keratinocytes
VerfasserTymciw, Thomas
Erschienen2014
Datum der AbgabeJuli 2014
SpracheEnglisch
DokumenttypBachelorarbeit
Schlagwörter (DE)Bovine / Fibroblasten / Keratinozyten / Laminitis / Thermolysin
Schlagwörter (EN)bovine / fibroblasts / keratinocytes / laminitis / thermolysin
Zugriffsbeschränkung
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Keratinozyten und Fibroblasten sind jene Zelltypen, aus denen die beiden Gewebeschichten Epidermis (Keratinozyten) und Dermis (Fibroblasten), hauptsächlich bestehen. In der Rinderklaue haben diese beiden Gewebeschichten die wichtige Funktion die innere Klauenwand mit dem Klauenbein zu verbinden.

Diese wichtige Struktur der Rinderklaue kann von einigen Krankheiten beeinflusst werden. Eine sehr verbreitete Krankheit ist Laminitis. Die Pathologie sowie die genaue Entstehung von Laminitis sind noch weitgehend unbekannt. Während des Krankheitsverlaufes verlieren Epidermis und Dermis ihre Bindung, das Klauenbein löst sich ab und beginnt zu rotieren. Dies führt zu großen Schmerzen beim Tier. Verminderte Milchproduktion sowie Behandlungskosten können in weiterer Folge zu wirtschaftlichen Verlusten führen.

Die Sektion der Klaue wurde durchgeführt, wie es von Nebel (2004) und Penner (2013) beschrieben wurde. Gewebe aus der Klaue und von der Haut wurde in Thermolysin inkubiert, um die Epidermis von der Dermis trennen zu können. Zwei Kultivierungsmethoden wurden getestet. Bei der Isolation einzelner Zellen wurde das Gewebe klein zerschnitten und nach Inkubation mit Trypsin wurden Zellen mit einer Dichte von 5 * 103 Zellen/cm2 ausgesäht. Bei der zweiten Methode wurden Gewebestücke direkt in Medium inkubiert und Zellen wuchsen von den Gewebestücken heraus.

Die Kultivierung von Fibroblasten war mit beiden Methoden erfolgreich. Das verwendete medium war DMEM (high glucose) wurde mit fetalem Kälberserum (10 %, FBS) und Antibiotika versetzt. Fibroblasten konnten erfolgreich kultiviert, passagiert (Passage 8) und kryokonserviert werden.

Keratinozyten wurden aus der Klaue und der Haut isoliert. Die Isolierung einzlner Zellen funktionierte besser mit Hautgewebe, die Inkubation von Gewebestücken besser mit Gewebe aus der Klaue. Zusätzlich wurden die Gefäße für Kultivierung von Keratinozyten mit Hilfe eines Coating Kits beschichtet. Die Verwendung des optimalen Mediums war jedoch am wichtigsten. Die besten Resultate wurden nach Kutiverung mit EpiLife Medium, versetzt mit Antibitika und dem HKGS Kit erzielt.

Die Kultivierung von Fibroblasten verlangte keine besonderen Bedingugnen im Bezug auf Medium oder Oberfläche der Kulturgefäße. Keratinozyten hingegen brauchen für ihr Wachstum ein spezielles Medium. Um das Wachstum und die Proliferation der Keratinozyten zu optimieren, könnte eine komplexere Oberflächenbeschichtung helfen.

Zusammenfassung (Englisch)

Keratinocytes and fibroblasts are two important cell types of the epidermis (keratinocytes) and dermis (fibroblasts) of the bovine claw. These two tissue types connect the inner claw wall and the pedal bone.

These important structures in the bovine claw are affected by several diseases. One very common disease is laminitis. The trigger factors and pathology of laminitis is still largely unknown. During the disease, the connective tissue separates from the pedal bone and leads to a rotation of the bone. This process results in pain for the animal. Reduced milk production and high treatment costs can further lead to economic losses.

The aim of this thesis was to improve the isolation and cultivation of keratinocytes and fibroblasts to provide an in vitro test system to study claw related diseases.

The dissection of the claw was done as described by Nebel (2004) and Penner (2013). Claw and skin explants were incubated with thermolysin to ensure an easy separation of dermis and epidermis. Two methods of cultivation were used. During single cell isolation, tissue was minced and was incubated with trypsin and cells were seeded with a density of 5 * 103 cells/cm2. During tissue outgrowth method, tissue pieces were directly incubated in medium.

The cultivation of fibroblasts worked with both cultivation methods. The medium used for fibroblasts was Dulbecco’s modified eagle’s medium (DMEM, high glucose) supplemented with fetal bovine serum (10 %, FBS), and antibiotics. It was possible to successfully cultivate, subcultivate (passage 8) and cryo preserve fibroblasts.

Keratinocytes were isolated from claw and skin tissue. The tissue outgrowth method was successful with claw tissue. Single cell isolation was successful using skin tissue. The culture flasks for cultivation of keratinocytes were coated with a collagen matrix. However, the medium, which is used, is very important for keratinocytes. Keratinocytes showed best proliferation with incubation with EpiLife medium supplemented with antibiotics and the human keratinocyte growth supplement (HKGS) kit.

Fibroblasts had no special requirements regarding medium or surface of the culture flasks. Medium for keratinocytes needs to be further optimized. Furthermore, more complex coating kits could help to improve culture conditions and therefore cell proliferation.