Titelaufnahme

Titel
PAK1-Regulation durch Opioide in humanen und murinen Brustkrebszellen
Weitere Titel
Regulation of PAK1 by opioids in humane and murine breast cancer cells
VerfasserMayer, Katharina
GutachterPrevedel, Christine
Erschienen2015
Datum der AbgabeJuni 2015
SpracheEnglisch
DokumenttypBachelorarbeit
Schlagwörter (DE)Brustkrebs / PAK1 / Opioide / Zellmigration
Schlagwörter (EN)Breast cancer / PAK1 / Opioid / Cell migration
Zugriffsbeschränkung
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Opioide sind stark wirksame Analgetika und der „Goldstandard“ in der Schmerztherapie. Allerdings ist die Anwendung von Opioiden bei Tumorpatienten fraglich, da Opioide scheinbar das Tumorwachstum und die Metastasierung begünstigen können. Die hierbei zugrunde liegenden Mechanismen sind jedoch noch nicht geklärt.

Die p-21 aktivierte Kinase 1 (PAK1) ist eine Serin/ Threonin Kinase, welche in vielen Tumoren exprimiert wird. Eine Überexpression und/ oder erhöhte Aktivität von PAK1 steht im engen Zusammenhang mit einer gesteigerten Proliferation und Migration von Tumorzellen. Eine Aktivierung von PAK1 kann durch verschiedene extrazelluläre Signale wie zum Beispiel Angiotensin durch eine Stimulation von G Protein gekoppelten AT1 Rezeptor erfolgen.

Die Opioidwirkung wird über Bindung und Aktivierung von G Protein gekoppelten µ-, δ- oder κ-Opioid Rezeptoren vermittelt. Opioid Rezeptoren werden in vielen malignen Zellen exprimiert und sind mit dem AT1 Angiotensin Rezeptor sehr eng verwandt. Es könnte daher vermutete werden, dass Opioide die Zellproliferation und Migration über eine Regulation von PAK1 vermitteln. Daten, die diese Hypothese unterstützen würden, existieren bislang nicht.

In dieser Studie wurde daher untersucht, ob Opioide eine Aktivierung von PAK1 in der murinen 4T1 und der humanen MDA-MB231 Brustkrebszelllinien auslösen können. Zunächst wurden die Zelllinien auf die Anwesenheit von µ-, δ- oder κ-Opioid Rezeptoren und PAK1 untersucht. Da eine Aktivierung von PAK1 über Serin und Threonin Phosphorylierung angezeigt wird, wurde in einem zweiten Schritt ein Protokoll etabliert, das einen Nachweis von phosphoryliertem PAK1 unter Verwendung von phospho-Serin und -Threonin spezifischen Antikörpern und der Blottechnick ermöglicht. Wir konnten zeigen, dass eine Behandlung von MDA-MB231 Zellen mit dem δ-Opioid Agonisten [D-Ala2, D-Leu5]-Enkephaline (DADLE) eine schwache Phosphorylierung von PAK1 an Serin 144 bewirkt. Eine Zellbehandlung mit dem µ-Agonisten [D-Ala2, N-MePhe4, Gly-ol]-Enkephalin (DAMGO), µ/δ-Rezeptor Liganden CYM 51010 und dem κ-Agonisten U50 488 führte zu einer Threonin 423 und Serin 144 Phosphorylierung. Eine Phosphorylierung von Serin 199 konnte jedoch für keine Opioidbehandlung beobachtet werden.

Im Gegensatz zu den MDA-MB231 Zellen, reagierten 4T1 Zellen auf eine Behandlung mit Threonin 423 und Serin 199 Phosphorylierung von PAK1. Allerdings war eine Inkubation der 4T1 Zellen mit DAMGO, CYM 51010 und U50 488 nur von einer Serin 144 Phosphorylierung begleitet. Auch in 4T1 Zellen konnte keine Serin 199 Phosphorylierung detektiert werden. Da eine Phosphorylierung von Serin 144 die katalytische Aktivität von PAK1 erhöht, lassen diese Ergebnisse eine PAK1 Aktivierung durch Opioide in murinen und humanen Brustkrebszellen vermuten.

Des weiterem wurde der Effekt von Opioiden auf die PAK1 Funktion getestet. Dafür haben wir unter Verwendung des so genannten „Scratch Assay“ den Einfluss von Opioiden auf die Migration von MDA-MB231 und 4T1 Zellen untersucht. Beide Zelllinien haben bereits eine hohe konstitutive Migrationsaktivität, welche durch eine Opioid-Behandlung nur geringfügig gesteigert werden konnte. Eine Inkubation der Zellen mit dem PAK1 Inhibitor IPA-3 verminderte zwar die Migration von MDA-MB231 Zellen, interessanterweise aber wiesen 4T1 Zellen weiterhin ein uneingeschränktes Migrationsverhalten auf. Außerdem konnte wir beobachten, dass durch die Opioide CYM 51010 und U50 488 die Hemmung von IPA-3 auf die konstitutive Migration von MDA-MB231 Zellen aufgehoben wird.

Zusammengefasst geben die Ergebnisse dieser Studie erste Hinweise darauf, dass Opioide eine Aktivierung von PAK1 in Brustkrebszellen auslösen könnten. Die Daten lassen weiterhin vermuten, dass U50 488 und CYM 51010 die Migration von MDA-MB231 Zellen möglicherweise über einen PAK1-unabhängigen Mechanismus unterstützen. Während der Durchführung dieser Studie ergaben sich immer wieder Probleme in der Detektion von phosphoryliertem PAK1. Vor einer Wiederholung und Weiterführung der Untersuchungen wäre daher eine Verbesserung des Nachweisverfahrens unbedingt erforderlich.

Zusammenfassung (Englisch)

Opioids are potent analgesic drugs and “gold standard” in treatment of severe pain, especially cancer pain. Nevertheless, opioid application in tumour patients has become matter of debate as there is increasing evidence that opioids may promote tumour growth and metastasis. The underlying signaling mechanisms, however, are largely unknown.

p-21 activated kinase 1 (PAK1) is a Serine/ Threonine kinase, which is expressed in many malignancies. Overexpression and/ or enhanced activity of PAK1 have been revealed to play a significant role in cancer cell proliferation and migration. PAK1 may be activated by different extracellular signals including angiotensin acting on G protein coupled AT1 receptor.

Effects of opioids require the binding and activation of G protein coupled µ-, δ- and/ or κ-opioid receptors. Opioid receptors are expressed in many malignant cells and are closely related to angiotensin receptors. Thus, opioids might be suggested to modulate cancer cell proliferation and migration via regulation of PAK1. Data supporting this hypothesis are missing.

Here we thus examined whether opioids may activate PAK1 in murine 4T1 and humane MDA-MB231 breast cancer cells. First we characterized breast cancer cells for the expression of µ-, δ- and κ--opioid receptors, and PAK1. As activation of PAK1 is indicated by Serine and Threonine phosphorylation, we next established a protocol to detect phosphorylated PAK1 in cell lysates by Western blotting employing phospho-Serine and phospho-Threonine specific antibodies. We revealed that treatment of MDA-MB231 cells with the δ-agonist [D-Ala2, D-Leu5]-enkephaline (DADLE) generated weak PAK1 phosphorylation on Serine 144, whereas incubation with the µ-agonist [D-Ala2, N-MePhe4, Gly-ol]-enkephalin (DAMGO), the µ/ δ- receptor binding ligand CYM 51010 and the κ-agonist U50 488 resulted in Threonine 423 and Serine 144 PAK1 phosphorylation. No Serine 199 phosphorylation was observed.

In contrast, DADLE treatment of 4T1 cells was accompanied with Threonine 423 and weak Serine 199 phosphorylation of PAK1. However, 4T1 cell incubated with DAMGO, CYM 51010 and U50 488 only exhibited Serine 144 phosphorylated PAK1. Again, no Serine 199 phosphorylation was observed. As Serine 144 phosphorylation is known to enhance the catalytic activity of PAK1, opioids might be thus suggested to induce PAK1 activation in murine and human breast cancer cells.

We also tested the effect of opioids on PAK1 function. By using the scratch assay, we assayed the influence of opioids on breast cancer cell migration. MDA MB231 and 4T1 cells exhibited high migration activity, which seems to be marginally accelerated in presence of the opioids. Interestingly, PAK1 inhibition by IPA-3 prevented constitutive MDA-MB231 migration, whereas 4T1 cells were left unaffected. In addition, we revealed that U50 488 and CYM 51010 treatment maintained MDA-MB231 migration in presence of IPA-3.

Taken together, our experiments give first evidence that opioids may activate PAK1 in breast cancer cells. Our data let also suggest that U50 488 and CYM 51010 support MDA-MB231 cell migration by a PAK1 independent mechanism. During our studies, we often run into problems to detect phosphorylated PAK1. Before starting further experiments, priority must be given to the refinement of the detection protocol.