Titelaufnahme

Titel
Etablierung einer zellkulturbasierenden Plattform für die Selektion hochexprimierender Faktor VIII kodierenden Sequenzen
Weitere Titel
Establishment of a cell culture-based expression platform for the screening of factor VIII coding sequences
VerfasserHübner, Catrin
Erschienen2015
Datum der AbgabeJuli 2015
SpracheEnglisch
DokumenttypBachelorarbeit
Schlagwörter (DE)Gentherapie / Faktor VIII / Expressionsplattform / CHO-S Zellkultur / HEK293 Zellkultur
Schlagwörter (EN)gene therapy / factor VIII / expression platform / CHO-S cell culture / HEK293 cell culture
Zugriffsbeschränkung
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Hämophilie A ist eine Bluterkrankheit, bei der der Koagulationsfaktor VIII (FVIII) fehlt oder defekt ist. Somatische Gentherapie ist hierfür eine vielversprechende Behandlungsmöglichkeit, da bereits eine geringe Zunahme an FVIII im Körper spontane Blutungen reduzieren und zu einem therapeutischen Erfolg führen kann. Der Schlüssel zu einer erfolgreichen Gentherapie liegt in der Generierung einer FVIII Expressionskassette, die eine hohe FVIII Expression bei gering gehaltener Vektoranzahl ermöglicht, um durch eine zu hohe Vektordosis eine mögliche heftige Immunantwort und den Verlust des Transgens zu vermeiden. Eine Möglichkeit die Expression zu steigern ist die Codonoptimierung der FVIII Sequenz. Das Ziel dieser Arbeit war es, eine zellkulturbasierende Plattform zu etablieren, mit der unterschiedliche FVIII codon-optimierte Sequenzen verglichen werden können. Dafür wurde eine chinesische Hamster Ovarzelllinie (CHO-S) und humane embryonale Nierenzelllinie (HEK293) eingesetzt, um drei codon-optimierte B-Domänen deletierte (BDD) FVIII Sequenzen (Konstrukte A-C), sowie die entsprechende Wildtyp BDD FVIII Sequenz (Konstrukt D) zu testen. CHO-S und HEK293 wurden dafür mit den Konstrukten transient transfiziert und die FVIII Sekretion über FVIII Aktivität gemessen. Zusätzlich wurden aus CHO-S stabile Zelllinien etabliert, deren FVIII Sekretion ebenfalls getestet wurde. Sowohl CHO-S als auch HEK293 sind als Expressionsplattform ungeeignet, da nicht zwischen den codon-optimierten Sequenzen unterschieden werden konnte und keine wiederholbaren und vergleichbaren Ergebnisse auftraten.

Zusammenfassung (Englisch)

For hemophilia A, a bleeding disorder caused by the absence or deficiency of the blood coagulation factor VIII (FVIII), somatic gene therapy is a promising tool. Only a modest increase in FVIII plasma levels in treated patients may reduce the rate of spontaneous bleeding leading to a therapeutic benefit. The key for successful FVIII gene therapy is the generation of a FVIII expression cassette that enables high level FVIII expression at reduced vector loads, since high vector doses may lead to detrimental immunologic responses and finally to the loss of transgene expression. Enhanced expression levels of FVIII may be achieved by codon optimization of the FVIII DNA sequence. The goal of this study was to establish a convenient cell culture-based test system to evaluate different codon optimizations of FVIII. For this, a Chinese hamster ovary (CHO-S) or a human embryonic kidney (HEK293) cell culture expression platform was established and the expression of three codon-optimized, B-domain-deleted (BDD) FVIII sequences (constructs A-C) as well as the wild-type BDD FVIII sequence (construct D) was evaluated. CHO-S or HEK293 cells were transiently transfected with the respective constructs and the activity of the secreted FVIII protein was tested. Additionally, stable cell lines of CHO-S were created and the FVIII activity was tested. Both, CHO-S and HEK293 expression platforms revealed to be inappropriate screening platforms to discriminate among different codon-optimized FVIII sequences with regard to repeatability and reliability.