Titelaufnahme

Titel
Epigenetischer Nachweis von oxidativem Stress bei Neugeborenen mit Phenylketonurie
Weitere Titel
Confirmation of epigenetic change due to oxidative stress in a newborn with phenylketonuria
VerfasserEscueta, Sharmane
Betreuer / BetreuerinGstinig, Karin
Erschienen2016
Datum der AbgabeJuni 2016
SpracheDeutsch
DokumenttypBachelorarbeit
Schlagwörter (DE)Phenylketonurie / Oxidativer Stress / Epigenetik / Glutathione-Peroxidase
Schlagwörter (EN)phenylketonuria / oxidative stress / epigenetic glutathione-peroxidase
Zugriffsbeschränkung
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Hintergrundinformation: Diese Arbeit beschäftigt sich mit Phenylketonurie (PKU), einer der häufigsten angeborenen Stoffwechselerkrankungen in der europäischen Bevölkerung mit einer Inzidenz von 1:10000.

Die Konsequenz einer hohen Phenylalaninkonzentration ist die erweiterte endogene Produktion der freien Radikale, sodass das Äquilibrium zwischen Schutzsystem und der freien Radikale kippt. Einige Studien haben die Beziehung von PKU zu oxidativem Stress dargestellt. Der oxidative Stress bei PKU-PatientInnen verursacht schwerwiegende Symptome, wie neurologische Defizite. Aus diesem Grund ist es wichtig ein Monitoring-System für den oxidativen Stress zu finden. Jedoch stellt die Messung der Antioxidantien eine Herausforderung bei Neugeborenen dar, weil die enzymatischen Antioxidantien noch nicht weit entwickelt sind und als Folge unspezifisch sind.

Ziel: Das Ziel ist es, eine alternative Überwachungsmethode der Antioxidantienaktivität für das Screenen des zuständigen Promotors vom GpX3-Gen zu finden, die auf oxidativen Stress spezifisch reagierende Nukleotide (5’-CGATTGGCTGCA-3’), welche eine Methylierung aufweisen können, enthalten. Somit könnte die Methylierungsveränderung ein Indikator für den oxidativen Stress sein.

Methode: Aus dem getrockneten Neugeborenenblut auf der Filterpapierkarte wurde die DNA isoliert. Schließlich wurde die Bisulfit-Behandlung durchgeführt, um methylierte von nicht-methylierten Cytosinen zu unterscheiden. Mit der PCR, hochauflösenden Schmelzanalysen und DNA-Sequenzierung wurde das Methylierungsmuster der Promotorregion des GpX3-Gens festgestellt.

Ergebnisse: Ein signifikanter Unterschied des Methylierungsmuster (p=0,033) bestand zwischen PatientInnen und Kontrollen. In 40 Stichproben (20 PatientInnen- und 20 Referenzproben) wurden vier Methylierungsveränderungen gefunden: CGATTGGCTGCA, CGATTGGC/TTGCA, C/TGATTGGC/TTGCA und TGATTGGTTGCA. Die Allelfrequenz bei PatientInnen lautete C|C=35%, C|C/T=10%, C/T|C/T=50% und T|T=5%. Bei den gesunden Proben war die Allelfrequenz C|C=60%, C|C/T=10%, C/T|C/T=30% und T|T=0%. TGATTGGTTGCA wurde zu CGATTGGCTGCA nach der phenylalaninarme Diät verändert.

Conclusio: Eine Demethylierung (T|T) bei einem/r PKU-PatientIn bestätigt eine epigenetische Veränderung des enzymatischen Antioxidans GpX3, die möglicherweise zu Aktivierung des Gens bei einem hohen Phe führt, welche zu Überproduktion an Radikalen führt. Somit wäre der/die PatientIn gegen H2O2 geschützt. T|T könnte möglicherweise als Biomarker für den oxidativen Stress bei Neugeborenen mit einer frühdiagnostizierten PKU eingesetzt werden, weil durch die epigenetische Verschiebung einer Demethylierung (ohne Ernährung, hohes Phe) zu einer kompletten Methylierung (mit Ernährung, niedriges Phe) bestätigt wurde, dass die Methyierungsveränderung mit oxidativen Stress zu tun hat.

Weitere Studien werden bei PKU-PatientInnen mit hoher Phe-Konzentration ohne T|T durchgeführt um das Methylierungsmuster von anderen enzymatischen Antioxidantiengenen wie SOD und KAT zu untersuchen.

Zusammenfassung (Englisch)

Introduction: This thesis deals with phenylketonuria (PKU), a genetically inborn error of amino acid metabolism with an incidence 1:10000 in Europe.

As a consequence of an increased phenylalanine (Phe) level, there is an enhanced endogenous production of free radicals, which interfere with balance between enzymatic antioxidants and reactive oxygen species. Several studies have shown that there is a relationship between PKU and oxidative stress. Oxidative stress has been suggested to be partly responsible for the late-onset neurological symptoms in PKU. Therefore, a monitoring of oxidative stress in children with PKU is essential. However, conventional measurements of the activity levels of enzymatic antioxidants have been challenging, especially in children with PKU.

Aims: The objective is to find an epigenetic biomarker for the monitoring of oxidative stress in early diagnosed PKU newborns. The promoter regions of the GpX3-genes have specific responsive nucleotides (5’-CGATTGGCTGCA-3’) for oxidative stress which contain cytosine bases that could undergo a DNA methylation. Therefore, a change in the DNA methylation could be an indicator of oxidative stress.

Methods: DNA was extracted from newborn dried blood spots. In order to distinguish methylated from unmethylated alleles, treatment with sodium bisulphite was necessary. To characterise the DNA methylation changes, PCR, high resolution melting and DNA-sequencing were carried out.

Results: The DNA methylation pattern showed a significant difference (p=0,033) between PKU patients and controls. Four different methylation alleles were found: CGATTGGCTGCA, CGATTGGC/TTGCA, C/TGATTGGC/TTGCA and TGATTGGTTGCA. The frequencies of the alleles in PKU children were C|C=35%, C|C/T=10%, C/T|C/T=50% and T|T=5%. The frequencies of the alleles in controls were C|C=60%, C|C/T=10%, C/T|C/T=30%, and T|T=0%. The TGATTGGTTGCA allele was converted to the CGATTGGCTGCA allele after a diet therapy.

Conclusion: An epigenetic change, demethylation (T|T), was confirmed in the promoter of enzymatic antioxidant GpX3 in a PKU patient, but not in controls. This suggests that the position of T|T is not blocked by a methylation and can be activated by radicals produced as a result of a high Phe in PKU. Therefore, T|T could be used as a putative epigenetic biomarker for a specific monitoring of oxidative stress due to extracellular hydrogen peroxide. In addition, the demethylation-methylation shift after diet therapy is suggested as a new epigenetic process.

Further studies have to be done on PKU patients with a high phenylalanine concentration, but without demethylation (T|T) in order to investigate the DNA methylation changes in the promotor region of other enzymatic antioxidant genes.