Titelaufnahme

Titel
Der epigenetische Nachweis von oxidativem Stress bei Neugeborenen mit Organazidämie
Weitere Titel
The epigenetic proof of oxidative stress in newborns with organic acidemia
VerfasserGothar, Kinga
GutachterZeyda, Karina
Erschienen2016
Datum der AbgabeJuni 2016
SpracheDeutsch
DokumenttypBachelorarbeit
Schlagwörter (DE)Allelverlust / Enzymmangel / epigenetische Biomarker / freie Radikale / IVA / Methylierungsmuster / MMA / Neugeborenenscreening / Organazidämie / oxidativer Stress / PA / Punktmutation
Schlagwörter (EN)allele loss / epigenetic biomarker / free radicals / IVA / methylation pattern / MMA / newborn screening / oxidative stress / PA / point mutation
Zugriffsbeschränkung
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Hintergrund: Vor allem die Entstehung von oxidativem Stress bei Neugeborenen und die Untersuchung auf epigenetischer Ebene sind noch unerforschte Gebiete in der Medizin. Neugeborene mit Organazidämie haben aufgrund ihrer Krankheit angehäufte toxische Metaboliten in ihrem Körper, die dazu führen, dass ein erhöhtes Risiko besteht, später oxidativen Stress zu entwickeln. Der Grund dafür sind die Metaboliten, die die DNA der Neugeborenen schädigen und somit, die für die Regulation von oxidativen Stress zuständigen enzymatischen Antioxidantien nicht mehr gebildet werden. Infolge dessen häufen sich freie Radikale im Körper an, schädigen unsere Zellen produzieren oxidativen Stress.

Das Ziel dieses Projektes ist es bei drei Tage alten Neugeborenen mit Organazidämie die epigenetischen Methylierungsmuster in den Genen, die für spezielle enzymatische Antioxidantien codieren, zu analysieren und mit gesunden Kontrollen zu vergleichen. Eventuelle spezifische Methylierungsmusterveränderungen bei den pathologischen Proben können für das frühzeitige Screening von oxidativen Stress verwendet werden.

Methode: Wir untersuchten die Methylierungsmuster in der Promoterregion der GpG-Inseln auf den beiden Allele der Gene für Glutathionperoxidase 3 (Gpx3) und Superoxid-Dismutase 3 (SOD3). Verglichen wurden 5 Neugeborene mit Isovalerianazidämie (IVA), 6 Neugeborene Methylmalonazidämie (MMA) und 9 Neugeborene mit Propionazidämie (PA) mit gesunden Kontrollen ohne Azidämien. Die DNA wurde aus Guthrie-Karten isoliert, Bisulfitbehandelt, danach wurde mit methylierten Primern eine PCR/HRM gemacht, diese in einem Agarosegel mittel Elektrophorese aufgetrennt und anschließend die Methylierungsmuster mittels Sequenzierung analysiert.

Ergebnisse und Conclusio: Bei dem Gen Gpx3 wurden die Methylierungsmuster C/C, C/C/T, C/T/C/T, T/T und Allelverluste gefunden. Allelverluste wurden nur bei Proben mit MMA und IVA detektiert, nicht bei Proben mit PA und Kontrollen. Da MMA und PA im Neugeborenenscreening denselben Metaboliten C3 aufweisen und bis jetzt nur durch Zusatzbestimmungen unterschieden werden konnten, könnte der Allelverlust als Marker für MMA und oxidativen Stress verwendet werden. Bei einer Probe mit PA wurden im Gen SOD3 auf nur einem Allel 25 methylierte C-Basen gefunden (=“skewed methylation“), was darauf hindeutet, dass sich im Körper verschiedene ROS befinden, die auf enzymatische Antioxidantien unterschiedlich sensitiv sind.

Zusammenfassung (Englisch)

Background: The origin of oxidative stress especially in newborn also considering the epigenetic levels is an unexplored field in medicine. Newborns with organic acidemia have accumulated toxic metabolites in their bodies, which lead to oxidative stress. These metabolites harm the DNA and so the enzymatic antioxidants, which regulate oxidative stress, cannot be produced and the free radicals cannot be eliminated. As a result the cells get damaged.

The aims of this project are to compare the changes in the methylation pattern of enzymatic antioxidants in three day old newborns with organic academia with healthy controls. Specific changes in the methylation pattern of the pathologic samples could serve as epigenetic biomarkers for the screening of oxidative stress.

Methods: We analyzed the methylation pattern in the promoter region of the CpG islands from the genes glutathione peroxidase 3 (Gpx3) and superoxide dismutase 3 (SOD3). We compared 5 newborns with isovaleric acidemia (IVA), 6 newborns with methylmalonic acidemia (MMA) and 9 newborns with propionic acidemia (PA) with healthy controls. The DNA was isolated from “Guthrie” cards of the newborn screening, after than it was treated by bisulfate, then PCR amplified using methylated primers and analyzed by high-resolution-melting (HRM). Afterwards the PCR products were seperated in an agarose gel by electrophoresis and the DNA methylation pattern analyzed by sequencing.

Results and conclusion: In the gene Gpx3 we found the changes C/C, C/C/T, C/T/C/T, T/T and allele signal loss. The allele signal loss was only found in patients with IVA and MMA but not in patients with PA and controls. So this methylation pattern could be used as a marker for oxidative stress in IVA and MMA patients. Additionally the newborn screening cannot differentiate between PA and MMA, so the allele loss could be used as a marker for MMA.

In PA we found a “skewed methylation” of the SOD3 gene, which showed a reduced intensity of the methylation product and upon sequencing one allele had a 25 C-base-methylation was confirmed. The Gpx gene of this patient showed no changes, which suggests the production of different types of ROS, that are sensitive to different enzymatic antioxidants.