Bibliographic Metadata

Title
Analyse von Transkriptvarianten von lncRNA in zellulärer Stressantwort mittels CRISPR/Cas9
Additional Titles
Studying Transcript Variants of a Long Non-coding RNA in Cellular Stress Response Using CRISPR/Cas9
AuthorKutzner, Leon
Published2016
Date of SubmissionSeptember 2016
LanguageEnglish
Document typeBachelor Thesis
Keywords (DE)CRISPR/Cas9 / lncRNA / Paraspeckel / RNA / NEAT1
Keywords (EN)CRISPR/Cas9 / lncRNA / paraspeckle / RNA / NEAT1
Restriction-Information
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Classification
Abstract (German)

NEAT1 ist ein RNA Gen auf dem Chromosom 11 des Humangenoms. Von dem Locus werden zwei Isoformen transkribiert, NEAT1_1 und NEAT1_2. Diese beiden Transkripte stellen einen wichtigen Bestandteil bei der Ausbildung von Paraspeckeln dar. NEAT1_1 ist eine 3,7kb lange nicht kodierende RNA (lncRNA), die kanonisch polyadenyliert wird. NEAT1_2 ist ein 23kb langes Transkript und entsteht dadurch, dass im Leseraster ohne die Aktivierung des kanonischen Signalwegs der Polyadenylierung von NEAT1_1 weitergelesen wird. Paraspeckels sind Ribonukleoproteinkomplexe, die sich in der Nähe von Splicing Speckeln im Nukleus befinden. Auch wenn die genaue Funktion von Paraspeckeln noch nicht gänzlich erforscht ist, werden Paraspeckles mit zellulären Stressreaktionen und Krankheiten wie Krebs und neurodegenerativen Erkrankungen in Verbindung gebracht. Hohe Expressionslevel von NEAT1 korrelieren dabei mit einem höheren Malignitätsgrad von Tumoren. Weitere Forschung in diesem Gebiet ist daher ausschlaggebend für das Verständnis der zellulären Stressreaktion und hat enormes Potential bei der Behandlung von Krebs oder neurodegenerativen Erkrankungen.

Im Zuge dieser Arbeit wurden HEK 293 Zellen mittels CRISPR/Cas9 genetisch modifiziert. Ziel war es, eine stabile Zelllinie zu etablieren, welche die lange Isoform NEAT1_2, jedoch nicht die kurze Version NEAT1_1 transkribiert. Die Strategie war, die gezielte Mutation der kanonischen Polyadenylierungsstelle (PAS), welche die Prozessierung des 3´ Endes von NEAT1_1 ermöglicht.

Für die spätere Untersuchung im Immunfluoreszenzmikroskop sollte ebenfalls eine, durch einen Gen-Knockout von NEAT1 modifizierte, Zelllinie etabliert werden. Diese diente zum einen als Negativkontrolle um Hintergrundlevels der Fluoreszenzsignale zu ermitteln und zum anderen dem Vergleich der Biogenese von Paraspeckeln in der Abwesenheit von der kurzen NEAT1_1 Variante.

Die sgRNAs für die PAS Mutanten wurden innerhalb der PAS Sequenz entworfen, diejenigen für den vollen Gen-Knockout von NEAT1 oberhalb bzw. nach dem NEAT1 Lokus. Das Schneiden des Cas9 Proteins am jeweiligen Lokus führt zu einem Doppelstrangbruch (DSB), der durch non-homologes End-paaren (NHEJ) oder, falls ein Reperatur Template vorhanden, durch homologe Rekombination (HR) wieder repariert wird. Humane embryonale Nierenzellen (HEK 293) wurden mit dem Cas9 Protein und den jeweiligen sgRNAs elektroporiert. Das Reparatur Template für die HR wurde mittels der auf Primern basierenden Klonierungstechnik FastCloning hergestellt.

Insgesamt wurden zwölf sgRNAs konstruiert und auf einen DSB kontrolliert. Dabei lieferte eine sgRNA positive Ergebnisse mit einer geringen Effizienz. Bei den restlichen sgRNAs konnte kein DSB an der erwarteten Stelle beobachtet werden. Eine Positivkontrolle, die in vorherigen Experimenten mit HEK 293 Zellen eine gute Effizienz an DSBs vorweisen konnte, lieferte keine positiven Ergebnisse in diesem experimentellen Aufbau. Daher sind Rückschlüsse auf die Effizienz der sgRNAs, die für diese Studie entworfen wurden, nicht möglich.

Abstract (English)

NEAT1 is an RNA gene encoding for two long non-coding RNAs (lncRNA) located on chromosome 11 in the human genome. The two isoforms of NEAT1, NEAT1_1 and NEAT1_2 are of significant importance for paraspeckle formation. NEAT1_2, a 23kb transcript, is a read-through of NEAT1_1 which is a canonically polyadenylated 3.7kb transcript. Paraspeckles are ribonucleoprotein complexes located in close proximity to splicing speckles in the nucleus. Although their exact mode of action remains unclear, they are linked to cellular stress responses and diseases like cancer and neurodegenerative disorders. Especially higher expression levels of NEAT1 are correlated with a higher malignancy of tumors. Therefore, further research in the field of NEAT1 and paraspeckles is relevant to understand the underlying molecular mechanisms.

In the course of this study, HEK 293 cells were genetically engineered using CRISPR/Cas9 with the goal to establish a stable cell line that transcribes only the long transcript NEAT1_2 but not the shorter version NEAT1_1. The strategy of choice was the mutation of the canonical polyadenylation site (PAS), which enables the 3´-end processing of NEAT1_1.

For later comparison of this mutant NEAT1_1 PAS cell line using an immunofluorescence microscope, a full knockout of NEAT1 was aspired. On the one hand, this would serve as a negative control to account for background noise of the fluorescence signal and on the other hand to compare the biogenesis of paraspeckles during absence of the short NEAT1_1 transcript.

SgRNAs were designed to target either the PAS or the proximate region upstream and downstream of NEAT1 for the full knockout. An electroporation of HEK 293 cells was done with the protein Cas9 and the sgRNAs. To repair the double strand break (DSB) created by Cas9, repair templates were designed and prepared using the primer-based cloning technique FastCloning.

In total, twelve sgRNAs were designed and subsequently tested for cleavage efficiency. The sgRNA gNEAT-KO_ds1 delivered positive results. All other sgRNAs did not lead to a DSB at the expected locus. A positive control sgRNA that previously showed good cleavage efficiency with HEK 293 cells was negative. This finding raises the question if the electroporation itself was working; therefore a final conclusion about the efficiency of individual sgRNAs designed for this study is impossible.