Titelaufnahme

Titel
Protein-Engineering einer pH-Schalter Laccase
Weitere Titel
Protein engineering of laccase towards a pH-trigger
VerfasserMatzinger, Bernhard
Erschienen2016
Datum der AbgabeSeptember 2016
SpracheEnglisch
DokumenttypBachelorarbeit
Schlagwörter (DE)Protein-Engineering / Laccase / S. cerevisiae / DMP assay / pH-Schalter / Expression level / SDS-PAGE visualisierung
Schlagwörter (EN)Protein engineering / Laccase / S. cerevisiae / DMP assay / pH-trigger / Expression level / SDS-PAGE visualization
Zugriffsbeschränkung
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Exprimiert man die Laccase von Melanocarpus albomyces in S. cerevisiae ist diese nicht in der Lage das Signalpeptid und einen 14 Aminosäuren langen Schwanz während der posttranslationalen Modifikation abzuspalten. Dieser Schwanz verringert die enzymatische Aktivität der Laccase. Ziel dieser Arbeit ist es, die Interaktion des Schwanzes mit dem Enzym zu untersuchen und herauszufinden, ob das Verhalten sich in Abhängigkeit von der Ladung des Schwanzes verändert. Dazu wurden Aminosäuren die sowohl bei pH 5 als auch pH 7 positiv bzw. negativ geladen sind an den letzten 8 Positionen des Schwanzes eine nach der anderen mittels ortsspezifischer Mutagenese eingebracht. Zusätzlich wurde Histidin eingebracht, welches bei pH 5 positiv, bei pH 7 aber negativ geladen ist. Die entstehende Variantenbibliothek wurde mit 2,6-Dimethoxyphenol als Substrat hinsichtlich enzymatischer Aktivität gescreened. Anschließend wurden die Varianten nach Konzentration und Deglykosylation auf einer SDS-PAGE analysiert um den Expressionslevel festzustellen.

Es wurde festgestellt, dass die enzymatische Aktivität nicht von der Ladung der Aminosäuresubstitutionen beeinflusst wird und eine pH-trigger Laccase durch einbringen von Histidinsubstitutionen nicht möglich ist.. Des Weiteren wurden mehrere Substitutionen entdeckt, die den Expressionslevel stark erhöhen.

Zusammenfassung (Englisch)

Expressed in S. cerevisiae, the laccase from Melanocarpus albomyces is unable to cleave off the signal peptide as well as a 14 C-terminus amino acid tail during post translational processing. This results in decreased enzymatic activity. The aim of this thesis is to understand the interaction of the tail with the laccase and study if the behavior changes according to the pH. In order to achieve this goal, positively and negatively side chain amino acids (at pH 5.0 and 7.0) were introduced, as well as histidine. Histidine was used as a “switchable” amino acid, since it is positively charged at pH 5.0 whereas for pH 7.0 it is negatively charged. The aforementioned amino acid substitutions were introduced one-by-one within the last 8 positions of the tail using site directed mutagenesis. The obtained library was screened for catalytic activity using 2,6-dimethoxyphenol as substrate. In order to check for expression mutants, a protocol for SDS-PAGE visualization was established that includes a concentration and further deglycosylation step.

It was found that the enzymatic activity was not influenced by introducing charged amino acids. Therefore, according to these results, no pH-trigger laccase is possible when the last 8 amino acid of the tails are mutated. Nevertheless, some positions were identified within the tail that increase the expression level of the laccase.