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Title
Ko-Aktivator YAP (Yes-associated protein) abhängige Genevaluierung in JEG-3 Zellen und frühen humanen Plazenten
Additional Titles
Co-activator YAP (Yes-associated protein)- dependent target gene evaluation in JEG-3 cells and early human placentae
AuthorLippitz, Sandra Maria
Thesis advisorKnöfler, Martin ; Seper, Helena
Published2017
Date of SubmissionJune 2017
LanguageEnglish
Document typeBachelor Thesis
Keywords (DE)Trophoblastendifferenzierung / YAP / Hippo pathway / ANXA3 / CDKN2a / CDK6 / CDX2 / CGB / ENDOU / OAF / PAGE4 / P63 / ZO-1
Keywords (EN)Trophoblast differentiation / YAP / Hippo pathway / ANXA3 / CDKN2a / CDK6 / CDX2 / CGB / ENDOU / OAF / PAGE4 / P63 / ZO-1
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Classification
Abstract (German)

Hintergrund: Während der plazentaren Entwicklung spielt die Trophoblastendifferenzierung eine wichtige Rolle beim Aufbau der föto-maternalen Kommunikation. Neben der Differenzierung zu extravillösen Trophoblasten, die maternale Spiralarterien invadieren, um einen Umbau der Arterien und einen adäquaten Blutfluss zum Fötus zu ermöglichen, können Zytotrophoblasten auch zum multinukleären Synzytium fusionieren. Dieses repräsentiert die äußerste Epithelschicht der plazentaren Chorionzotten und stellt gleichzeitig die Oberfläche für den föto-maternalen Austausch dar. Weil bisher nicht geklärt ist welche Mechanismen die Entscheidung der Zytotrophoblasten beeinflussen zu proliferieren oder in einen der genannten Zelltypen zu differenzieren, beschäftigt sich diese Bachelorarbeit mit der Annahme, dass der Transkriptionskoaktivator YAP die Entscheidung zu proliferieren beeinflusst. Der Fokus liegt auf YAP, da es dafür bekannt ist, eine Schlüsselrolle in Zellproliferation und Organwachstum zu spielen.

Methoden: Ein Knock-out des Faktors YAP in trophoblastären Zelllinien aus JEG-3 Choriokarzinoma Zellen führte zu einer veränderten RNA-Expression von 244 mRNAs aus denen mehrere trophoblast-spezifische Gene ausgewählt wurden. Es wurde festggestellt, dass sechs Gene (ANXA3, CDK6, CDX2, PAGE4, p63, ZO-1) eine erniedrigte Expression in YAP knock-out Zellen aufweisen, während sich eine erhöhte RNA-Expression von vier weiteren Genen (CDKN2a, CGB, ENDOU, OAF) zeigte. Um diese Resultate auf Proteinebene zu verifizieren, wurden Western Blot Analysen durchgeführt. Des Weiteren wurden Immunfluoreszenzfärbungen der Zielgene auf humanen plazentaren Geweben des frühen, mittleren und späten ersten Trimesters angefertigt um die Proteine in Trophoblasten nachzuweisen.

Resultate: Die veränderte RNA-Expression der YAP Knock-out (KO) JEG-3 Choriokarzinoma Zellen verglichen mit den YAP Wildtype (WT) JEG-3 Choriokarzinoma Zellen konnte auf Proteinebene für alle Zielgene verifiziert werden. Lediglich ZO-1 wies eine gesteigerte Proteinexpression in YAP KO Zellen auf, obwohl diese der Erwartung nach sinken sollte. Weiters konnte das Ergebnis der Western Blot Analyse für die OAF Proteinexpression nicht ausgewertet werden, da keine verwendbaren Banden detektiert werden konnten. Das Ergebnis der Immunfluoreszenzfärbung bestätigte die Präsenz von ANXA3, CDK6, CDX2, PAGE4, p63 und ZO-1 Genprodukten im Kern der Zytotrophoblasten, während Genprodukte von ZO-1 zusätzlich auch an Zellverbindungen nachgewiesen wurden. Genprodukte von ENDOU, CGB und OAF konnten dem Zytoplasma des Synzytiums zugewiesen werden und jene von CDKN2a wurden im Nukleus beider Zelltypen gefunden.

Conclusio: Die Hypothese, dass aktives YAP an der Aufrechterhaltung der „Stammzellartigkeit“ von Zytotrophoblasten beteiligt ist, konnte durch Ergebnisse dieser Arbeit gestärkt werden. Weiters wurde eine Basis für weitere Forschung an diesem Thema und an der Art, wie YAP die stammzell-ähnlichen Eigenschaften der Zytotrophoblasten in Interaktion mit den beschriebenen Genen fördert, geschaffen.

Abstract (English)

Background: During placental development differentiation of trophoblasts is an essential step to build up the fetal-maternal communication. Besides differentiation into extravillous trophoblasts (EVTs), that invade maternal spiral arteries to promote remodeling and adaption of blood flow to the fetus, progenitor trophoblasts also fuse and form the multinucleated syncytium, which represents the outer epithelial layer of chorionic villi and acts as a fetal-maternal exchange surface. Since it is not yet known which mechanisms regulate the decision of progenitor cytotrophoblasts (CTBs) to either remain in a proliferating state or to differentiate in one of the above-mentioned cell types, this bachelor thesis is going to elaborate the assumption that the transcriptional co-activator YAP is involved in maintaining stemness of CTBs. The focus was laid on YAP, because it´s activity is known to play a key role in cell proliferation and growth of whole organs.

Methods: A knock out of YAP in trophoblastic JEG-3 choriocarcinoma cells resulted in the identification of 244 regulated genes. Of these, six genes expressing lower RNA levels (ANXA3, CDK6, CDX2, PAGE4, p63, ZO-1) and four genes expressing higher RNA levels (CDKN2a, CGB, ENDOU, OAF) were selected for further molecular analyses. To verify the expression at the protein level, western blot analysis was performed. Additionally, immunofluorescence staining of the target proteins was implemented on human placental tissue of the early, the middle, and the late first trimester of gestation to proof that the genes are trophoblast specific.

Results: Altered RNA expression of YAP knockout (KO) JEG-3 choriocarcinoma cells compared to wildtype (WT) JEG-3 choriocarcinoma cells could be reflected on protein levels for all target genes except ZO-1, which showed an increased protein expression in YAP KO cells, even though protein expression was assumed to decrease. Western blot analysis for OAF protein expression did not result in evaluable bands and was therefore not taken into account. Immunofluorescence staining confirmed the presence of ANXA3, CDK6, CDX2, PAGE4, p63 in nuclei of vCTBs, while ZO-1 gene products were additionally detected at intercellular boundaries. Gene products of ENDOU, CGB and OAF were confined to the cytoplasm of the syncytium and CDKN2a expression was detected in nuclei of both cell types.

Conclusio: Through results of this project the hypothesis is strengthened that active YAP is involved in maintaining stemness of CTBs and the base for further research on this topic and on how stemness is maintained by YAP in interaction with described target genes is built.

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