Titelaufnahme

Titel
Etablierung von zellulären Hilfsmitteln zur Untersuchung der parakrinen Effekte von stromalen Wnt2 auf Endothelzellen
Weitere Titel
Establishment of cellular tools to investigate the paracrine effects of stromal Wnt2 on endothelial cells
VerfasserSchwarz, Katharina
GutachterDolznig, Helmut ; Zahradnik, Michaela
Erschienen2017
Datum der AbgabeJuni 2017
SpracheEnglisch
DokumenttypBachelorarbeit
Schlagwörter (DE)Wnt2 / Kolorektale Karzinome / Endothelzellen / Afamin / Ko-Kulturen / Konditioniertes Medium
Schlagwörter (EN)Wnt2 / Colorectal cancer / Endothelial cells / Afamin / Co-culture / Conditioned medium
Zugriffsbeschränkung
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Die Wnt Signalübertragung ist essentiell für die Erhaltung der Stammzellen und der Darmhomöostase. Mutationen im kanonischen Wnt Signalweg sind dafür bekannt, schon für frühe Ereignisse in der Tumorentstehung und -progression verantwortlich zu sein und scheinbar auch eine Rolle in der Metastasierung zu spielen. Zuletzt konnte gezeigt werden, dass die stromalen Tumor-assoziierten-Fibroblasten (TAF) im gastrointestinalen Trakt eine Wnt2 Überexpression aufweisen. In der aktuellen Literatur wird Wnt2 als Aktivator des kanonischen Signalwegs gehandelt und scheint es auch eine Rolle in der Angiogenese zu spielen. Dieser Effekt von Wnt2 auf Endothelzellen (EZ) ist noch weitgehend unbekannt und daher braucht es zu diesem Thema noch weitere Untersuchungen.

In vitro Studien mit Wnt Proteinen sind schwierig, da diese Proteine posttranslational durch einen Palmitatrest modifiziert sind, der dazu führt, dass sie hydrophobe Eigenschaften annehmen. Dies hemmt die Sekretion von Wnt Proteinen in das Zellkulturmedium. Weiters gibt es rekombinant produzierte Proteine, die aber meist nicht biologisch aktiv sind.

Das große Ziel dieser Arbeit ist es Hilfsmittel für eine effiziente Wnt2 Sekretion in das konditionierte Medium (KM) von kultivierten Zellen zu finden. Kürzlich wurde gezeigt, dass bei einer Ko-Expression des Serumproteins Afamin, wasserlösliches und biologisch aktives Wnt von Wnt-produzierten Zellen gewonnen werden kann,. Wir wollten zeigen, ob dieses Ergebnis auch für Wnt2 erzielt werden kann, was ermöglichen würde, die Effekte von Wnt2 auf anderen Zellen zu testen. Leider schafften wir es nicht biologisch aktives Wnt2 im KM von Wnt2-produzierenden L-Zellen bei einer gleichzeitigen Afamin Ko-Expression zu erhalten.

Somit ist zurzeit die einzige Alternative, um den Effekt von Wnt2 auf EZ testen zu können, eine Ko-Kultur mit Wnt2-produzierenden Zellen. Wir wollten eine Zelllinie finden, die selbst nicht autokrin auf Wnt2 reagiert, da Signalübertragungen in der Wnt-produzierenden Zelle einen zusätzlichen Effekt auf EZ haben könnte, der die Analyse des direkten Einflusses von Wnt2 auf EZ erschweren würde. Weiters muss es möglich sein, diese Zelllinie mit EZ zu kultivieren. Wir fanden eine immortalisierte humane Fibroblasten-Zelllinie (CT5.3) die ein potentieller Kandidat ist, da in einem Reporter-Assay gezeigt werden konnte, dass diese Zelllinie nicht auf Wnt2 reagiert. Weiters konnten wir optimale Bedingungen für eine Ko-Kultur mit EZ und CT5.3 finden. Das setzt den Grundstein für weitere funktionelle Experimente, um die zellulären und molekularen Effekte von Wnt2 auf EZ zu identifizieren.

Zusammenfassung (Englisch)

Wnt signaling is known to be critical for stem cell maintenance and intestinal homeostasis. Mutations in the canonical Wnt signaling pathway are early events in tumor initiation, progression and also might play a role in metastasis. Recently Wnt2 was found to be overexpressed in tumor stromal cancer-associated fibroblasts (CAFs) in the gastrointestinal tract. In the literature Wnt2 is discussed to be a canonical Wnt ligand that might play a role in angiogenesis, but the exact effect of Wnt2 on endothelial cell (ECs) is widely unknown. Therefore, this topic needs further investigation.

In vitro studies with Wnts are challenging as Wnt proteins are post-translationally modified with a palmitate which renders them hydrophobic and impedes secretion of Wnt proteins into the cell culture medium. Furthermore, recombinantly produced proteins often lack biological activity.

The major goal of this thesis was to generate a tool for efficient Wnt2 secretion into the conditioned medium (CM) of cultured cells. Recently, it was shown that water soluble and biologically active forms of Wnt proteins can be obtained from Wnt expressing cells by co-expression of the serum protein Afamin. We aimed to test if this is also true for Wnt2 as this would facilitate assessing the effects of stromal Wnt2 on other cells. Unfortunately, we could not obtain biologically active Wnt2 in CM by co-expressing of Afamin in L-cells overexpressing Wnt2.

Thus, so far the only alternative is to test the effect of this ligand on ECs is a co-culture with Wnt2-producing cells. We aimed to find a cell line which lacks autocrine responsiveness to Wnt2 since signaling in the Wnt-producing cells might have an additional effect on ECs complicating the analysis of the direct effects of Wnt2 on ECs. Moreover, these anticipated producer cells have to be suitable to allow co-cultures with ECs. We found an immortalized human fibroblast cell line (CT5.3) as a potential candidate as we demonstrated their lack of responsiveness to Wnt2 in a reporter assay. Furthermore, we were able to optimize co-culture conditions for a co-culture with ECs and CT5.3. This set the ground for further functional experiments to identify the cellular and molecular effects of Wnt2 on vascular cells.