Titelaufnahme

Titel
Klonieren, Exprimieren und Analysieren von rekombinanten Fischallergenen
Weitere Titel
Cloning, Expression and Analysis of Recombinant Fish Allergens
VerfasserGöber, Samantha Vanessa
GutachterRaith, Marianne
Erschienen2017
Datum der AbgabeJuni 2017
SpracheEnglisch
DokumenttypBachelorarbeit
Schlagwörter (DE)Fisch / Nahrungsmittelallergie / Parvalbumin / Aldolase / Enolase
Schlagwörter (EN)fish / type I food allergy / parvalbumin / aldolase / enolase
Zugriffsbeschränkung
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Nahrungsmittelallergien oder Typ 1 Allergien sind IgE-mediierte Hypersensitivitätsreaktionen und vor allem in Industriestaaten weit verbreitet. Dabei bildet das Immunsystem spezifische IgE-Antikörper nach Erstkontakt mit einem Allergen aus, welche an Fcε-Rezeptoren 1 (FcεRI) auf Effektorzellen, wie zum Beispiel Mastzellen binden. Bei einem weiteren Kontakt mit dem Allergen kommt es zur Kreuzvernetzung der FcεRI gebundenen IgE-Antikörper und dadurch zu einer Aktivierung von Effektorzellen und zur Ausschüttung von Mediatoren, welche zu Symptomen wie Hautausschlag, Durchfall oder Erbrechen und im schlimmsten Fall zu lebensbedrohlichen Reaktionen, wie einem anaphylaktischen Schock führen können. Derzeit sind die einzigen Behandlungsmethoden, Vermeidung der Aufnahme des Allergens oder Behandlung der allergischen Symptome. Die einzige kausale Therapie sind Immuntherapien, die derzeit mit Extrakten von Allergenquellen durchgeführt werden.

Fisch zählt zu den acht Nahrungsmitteln, welche am häufigsten für Typ 1 Allergien verantwortlich sind. Dabei reagieren etwa 95% der Patienten auf Parvalbumin (PV), ein calciumbindendes Protein, das Hauptallergen im Fisch. Allerdings gibt es neben dem PV auch andere Proteine wie zum Beispiel Aldolase (Fructose-1,6-bisphosphat Aldolase) und Enolase (beta-Enolase), welche ebenfalls als Allergene identifiziert wurden.

Das Ziel dieser Bachelorarbeit war es aus der Forelle (Oncorhynchus mykiss) sowohl das bereits bekannte Allergen PV als auch die Allergene Aldoalse und Enolase rekombinant herzustellen. In weiterer Folge sollte das Allergiepotenzial des Forellen-PVs mit dem PV von Tunfisch, Kabeljau, Makrele, Lachs und Karpfen, welche ebenfalls rekombinant hergestellt wurden, verglichen werden. Im Zuge dieser Arbeit konnten Forelle PV, Aldolase und Enolase in rekombinanter Form mit einem C-Terminalen Histidin-tag hergestellt werden. Dafür wurde die amplifizierte cDNA in einen bakteriellen Expressionsvektor kloniert, anschließend in BL-21 kompetenten E.coli Zellen exprimiert und mittels Nickel-Affinitätschromatographie aufgereinigt. Das PV der Forelle wurde ebenfalls mittels Affinitätschromatographie und auch mittels Ionenaustauschchromatographie aufgereinigt. Im nächsten Schritt wurden die rekombinanten Proteine Aldolase, Enolase und die Parvalbumine in Immunoblots mit Parvalbumin-spezifischen Antiseren getestet und ihre IgE-Reaktivität mit Patientenseren von Fischallergikern in einem ELISA evaluiert. Die Seren von Fischallergikern zeigten eine erhöhte IgE-Reaktivität auf das PV der Forelle und, in geringerer Intensität, auch eine IgE-Reaktivität auf die Aldolase und Enolase.

PV, Aldolase und Enolase von der Forelle konnten erfolgreich kloniert und exprimiert und auf deren IgE-Reaktivität getestet werden. Damit wurde ein wichtiger Schritt gesetzt, um diese rekombinanten Proteine möglicherweise in Zukunft in der Diagnose und Therapie von Fischallergien zu verwenden.

Zusammenfassung (Englisch)

Food allergies or type I allergies are IgE-mediated hypersensitivity reactions, common in industrialized countries. In type I allergies, after the first exposure to the allergen, the immune system produces specific IgE-antibodies, which can bind to the Fcε-receptor I (FcεRI) on effector cells, such as mast cells. After another contact with the allergen, FcεRI-bound IgE antibodies on effector cells can be crosslinked by the allergen and thus become activated, resulting in a release of mediators. These mediators can initiate symptoms such as skin rashes, diarrhea or vomiting, and, in worst case, can also lead to life threating reactions, such as an anaphylactic shock. Currently, the only treatments are to avoid the intake of allergen-containing food or to treat the symptoms of an allergic reaction. However, the only causative treatment of allergies is a specific immunotherapy using allergen extracts.

Fish belongs to the eight most allergenic foods, which are responsible for type I allergies. 95% of the patients show reactivity to the calcium-binding protein parvalbumin (PV), the major allergen in fish. However, in the last years, also other proteins were identified as allergens in fish, such as aldolase (Fructose-1,6-bisphosphat Aldolase) or enolase (betaEnolase).

The aim of this thesis was to produce the already known PV, and the putative allergens aldolase and enolase from trout (Oncorhynchus mykiss) in recombinant form. Additionally, the allergenicity of the trout PV should be compared to the recombinant PVs of tuna, codfish, mackerel, salmon and carp. Trout PV, aldolase and enolase carrying a C-terminal histidine-tag were produced in recombinant form. For this, the amplified cDNA was cloned into a bacterial expression vector, expressed in competent E.coli BL-21 cells and the protein was purified using affinity chromatography. PV from trout was purified using affinity chromatography and in the second step using an ion exchange chromatography. The purified aldolase, enolase and PVs were tested using immunoblots with parvalbumin specific antibodies and their IgE reactivity was evaluated in ELISA using sera from patients with a known sensitization to fish. Sera from fish allergic patients showed increased IgE reactivity to the PV from trout and lower IgE reactivity to aldolase and enolase.

PV, aldolase and enolase were successfully cloned, expressed and tested for their IgEreactivity. Thus, an important step towards a further application of the recombinant allergens for improved diagnosis and therapy of fish allergies was made.