Titelaufnahme

Titel
Effekte der Signaltransduktion auf post-translationelle Modifikationen von MITF in Melanom
Weitere Titel
Signaling effects on post-translational modifications of MITF in melanoma
VerfasserIonasz, Vivien-Sandra
Erschienen2017
Datum der AbgabeJuni 2017
SpracheEnglisch
DokumenttypBachelorarbeit
Schlagwörter (DE)Signaltransduktion / Targeting / Transkriptionsfaktor / MITF / Melanom / Krebs / Grundlagenforschung / Post-translationelle Modifikationen / Phosphorylierung / Kinasen
Schlagwörter (EN)Signaling / Targeting / Transcription factor / MITF / Melanoma / Cancer / Basic research / Post-translational modifications / Phosphorylation / Kinases
Zugriffsbeschränkung
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Der Mikrophthalmie-assoziierte Transkriptionsfaktor (MITF) ist ein Helix-loop-helix-Transkriptionsfaktor aus der Gruppe der Leucin-Zipper, der wesentlich für die Regulierung der Melanocyten ist. Zudem ist MITF ein zentrales Element stromabwärts vieler Signalwege, welche oft im Melanom dereguliert sind. Um kinase-vermittelte post-translationelle Modifikationen von MITF zu untersuchen, wurden drei stabile Doxycyclin-induzierbare MITF-FLAG-HA-exprimierende Melanomzelllinien generiert. Diese Zelllinien wurden für die Charakterisierung von MITF, im Bezug auf das Bandenmuster und die Lokalisierung mittels Western Blot und Konfokalmikroskopie, benutzt. Unsere Ergebnisse zeigten, dass MITF in 501mel, A375P und 1205Lu unter normalen Bedingungen nukleär ist. Bei dem Aushungern der Zellen von Serum und Aminosäuren wurde jedoch festgestellt, dass MITF in A375P cytoplasmatisch wurde. Inhibitionsexperimente zeigten offensichtliche Veränderungen im Bandmuster von MITF, was darauf hindeutet, dass mehrere Kinasen einschließlich BRAF, GSK3 und mTOR diesen Transkriptionsfaktor im Melanom phosphorylieren. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass einige dieser Inhibitoren das Verhältnis von MITF innerhalb des Nukleus und des Cytoplasmas beeinflussen. Schließlich zeigten unsere Daten, dass die Phosphorylierung von S73 für die subzelluläre Lokalisation von MITF wichtig ist und einen großen Einfluss auf das Bandmuster des Proteins hat. Darüber hinaus wurde durch die Verwendung eines phosphospezifischen MITF-Antikörpers festgestellt, dass S73 nach einer BRAF-Inhibition weiterhin phosphoryliert bleibt. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass MITF von zahlreichen Kinasen angegriffen wird, die seine subzelluläre Lokalisation im Melanom steuern.

Zusammenfassung (Englisch)

Microphthalmia-associated transcription factor (MITF) is a basic helix-loop-helix leucine zipper transcription factor crucial for the regulation of melanocytes. Importantly, MITF is a central element downstream of signaling pathways that are frequently deregulated in melanoma. To study kinase-mediated post-translational modifications of MITF, three stable doxycycline-inducible MITF-FLAG-HA-expressing melanoma cell lines were generated. These cell lines were used for the characterization of MITF in terms of its band pattern and localization using Western blotting and confocal microscopy. Our results showed that MITF is nuclear in 501mel, A375P and 1205Lu under normal conditions. However, upon serum and amino acid starvation, MITF was found to be cytoplasmic in A375P cells. Kinase inhibition experiments revealed obvious changes in the band pattern of MITF, suggesting that multiple kinases including BRAF, GSK3 and mTOR phosphorylate this transcription factor in melanoma. Furthermore, some of these inhibitors were shown to affect the nuclear-to-cytoplasmic ratio of MITF. Finally, our data revealed that phosphorylation of S73 is important for the subcellular localization of MITF and has a major impact on the band pattern of the protein. Moreover, by using a phospho-specific MITF antibody, we found that S73 remains phosphorylated upon BRAF inhibition. Taken together, our findings strongly suggest that MITF is targeted by numerous kinases that modulate its subcellular localization in melanoma.