Titelaufnahme

Titel
Klonierung, Expression und Charakterisierung einer neuen NrdJd-unterklasse
Weitere Titel
Cloning, Expression and Characterization of a novel NrdJd-subclass
VerfasserKabinger, Florian
Erschienen2017
Datum der AbgabeJuni 2017
SpracheEnglisch
DokumenttypBachelorarbeit
Schlagwörter (DE)Ribonukleotid reduktase / NrdJd (class II RNRs) / Klonierung großer Gene / Biochemische Charakterisierung / Oligomerisationszustände / cryo EM
Schlagwörter (EN)ribonucleotide reductases / NrdJd (class II RNRs) / cloning of large genes / biochemical characterization / oligomeric states / cryo EM
Zugriffsbeschränkung
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Deoxyribonukleotide (dNTPs) sind die Bausteine der DNA und sind deshalb essentiell für jede Form von Leben. Ribonukleotid reduktasen (RNRs) katalysieren eine Kernreaktion der Biosynthese von dNTPs. Ribonukleotide, die Bausteine der RNA, sind Vorläufermoleküle von dNTPs. RNRs katalysieren die Substitution des 2´OH von NTP zu einem Wasserstoff. Der ungewöhnliche Mechanismus der Reduktion, welcher ein Thiylradikal beinhaltet, ist evolutionär konserviert. Das Ziel dieses Projektes war es, einen Vetreter der vergleichsweise wenig erforschten Subklasse von NrdJd3 zu charakterisieren. Gene der Subklasse NrdJd3 sind besonders, da sie zusätzliche Seqeunzregionen besitzen, welche auf unbeschriebene biologische Funktionen hindeuten. Aufgrund der Komplexität der Klonierung derart großer Gene in einen vergleichsweise kleinen Vektor, wurden fünf unterschiedliche Kloningsmethoden angewandt. Auf diese Weise klonierten und exprimierten wir vier von fünf Genen. Wir produzierten reines und aktives Enzyme für eine biochemische Analyse. Eine kinetische Charakterisierung durch Aktivitäts - Assays zeigte die Abhängigkeit von unterschiedlichen Cofaktoren und den Einfluss von unterschiedlichen Substraten beziehungsweise Effektoren. Untersuchungen der Oligomerisationszustände zeigte das Vorhandensein von Oligomeren mit hohen Molekulargewicht. Durch Deletion von zwei Domänen untersuchten wir die Funktion der zusätzlichen Sequenzregionen. Signifikante unterschiede im Bezug auf isolierte Oligomerisationszustände deuten auf die Wichtigkeit dieser zusätzlichen Sequenzregionen hin.

Zusammenfassung (Englisch)

Deoxyribonucleotides (dNTPs) are the building blocks of DNA and are therefore essential for any form of life. Ribonucleotide reductases (RNRs) catalyze a core reaction during dNTP biosynthesis. Ribonucleotides (NTPs), the building blocks of RNA, are the precursor molecules of dNTPs. RNRs catalyzes the substitution of the 2´OH of NTPs with a hydrogen. The unusual mechanism of the reduction, which involves a thiyl-radical, is well conserved in an evolutionary sense. The aim of this project was to characterize a RNR of the comparatively poorly investigated subclass NrdJd3. Genes of NrdJd3s are outstanding because of additional sequence regions which indicate the presence of so far unknown biological functions. Due to the complexity of cloning such large genes into comparably small vectors, five different cloning methods were applied. In this manner, we succeeded to clone and express 4 of 5 genes. We managed to produce pure and active enzyme for biochemical analyzation. Kinetic characterization via activity assays showed the dependence on different cofactors and the influence of different substrates and effectors, respectively. Investigation of oligomeric states revealed the presence of high oligomeric forms of the enzyme. We studied the function of additional sequences of the subclass by genetically deleting two domains of the protein. A strong correlation between isolated high oligomeric states and one additonal sequence feature was detected.