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Title
Optimierung der Methode zum Nachweis von Mutationen in der BCR-ABL1 Kinase Domäne
Additional Titles
Optimization of the detection method of mutations within the BCR-ABL1 kinase domain
AuthorWallner, Melanie
Published2017
Date of SubmissionJune 2017
LanguageGerman
Document typeBachelor Thesis
Keywords (DE)reziproke Translokation der Chromosomen 9 und 22 / BCR-ABL1-Fusionsgen / Philadelphia Chromosom / chronische myeloischer Leukämie (CML) / PCR basierte Technik / Agarosegelelektrophorese / DHPLC / Mutationsnachweis in der BCR-ABL1 Kinase Domäne / Sanger Sequenzierung / Optimierung der cDNA-Synthese / Optimierung der nested PCR / Ziel: robuste Amplifikation bei niedrigen BCR-ABL1/ABL1-Verhältnissen
Keywords (EN)reciprocal translocation of the chromosoms 9 and 22 / BCR-ABL1 fusion gene / Philadelphia chromosome / chronic myeloid leukemia / PCR based method / Agarose gel electrophoresis / DHPLC / detection of mutations within the BCR-ABL1 kinase domain / Sanger Sequencing / Optimization of the cDNA synthesis / Optimization of the nested PCR / aim: robust amplification at low BCR-ABL1/ABL1 ratios
Restriction-Information
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Classification
Abstract (German)

Die BCR-ABL1-Fusion entsteht durch die Translokation der Chromosomen 9 und 22. Diese spielt eine therapeutische Rolle bei chronischer myeloischer Leukämie (CML) und bei Philadelphia-positiver akuter lymphatischer Leukämie (ALL). Mutationen in der BCR-ABL1-Kinasedomäne können zu Resistenzen gegen Tyrosinkinaseinhibitoren (TKI) führen. Der Mutationsnachweis mittels Sanger Sequenzierung ist entscheidend für die Therapieauswahl und die Überwachung der Krankheit. Ziel des Projektes war die Optimierung der Amplifikation des BCR-ABL1-Transkriptes zur Detektion von therapierelevanten Mutationen bei niedrigen BCR-ABL1/ABL1-Verhältnissen (IS-Wert < 1%). Im Zuge des Mutationsnachweises wird eine nested PCR durchgeführt, wobei die Amplifikate der PCR2 sequenziert werden. In der ersten PCR erfolgt eine Selektion zwischen BCR-ABL1-Fusionstranskript und ABL1-Wildtyp-Allel. Um die Sensitivität dieser Methode zu erhöhen wurden verschiedene Primer und DNA Polymerasen getestet. Schlussendlich wurde die Q5 Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase (NEB) ausgewählt. Weiters wurde die reverse Transkription mit einem genspezifischen Primer, welcher an der Exongrenze 9-10 des ABL1 Gens bindet, und der reversen Transkriptase SuperScript IV (ThermoFisher Scientific) optimiert. Bei der Validierung konnte eine robuste Amplifikation in der PCR1 bis zu einem IS-Wert von 0,00072% erreicht werden und die Methode wurde in die Routinediagnostik eingeführt.

Abstract (English)

The BCR-ABL1 fusion, originating from the reciprocal translocation between chromosomes 9 and 22, is a therapeutic target in chronic myeloid leukemia and Philadelphia-positive acute lymphocytic leukemia. Nevertheless, mutations in the kinase domain of BCR-ABL1 can cause resistance to tyrosine kinase inhibitors. Their detection by Sanger sequencing is crucial for further therapeutic decisions and disease monitoring. Aim of the project was the improvement of the amplification of the BCR-ABL1 fusion transcript in order to detect therapy-relevant mutations at low BCR-ABL1/ABL1 ratios (IS values) below 1%. For that purpose a nested PCR is performed and the amplicons generated in the second PCR are sequenced. The selection between the fusion transcript and the wild type ABL1 allele takes place during the first round of PCR. We therefore aimed to raise its sensitivity by testing various primers and polymerases and finally selected the Q5 Hot Start High-Fidelity DNA polymerase (NEB). Furthermore, we optimized reverse transcription with a gene specific primer from the exon boundary 9-10 of the ABL1 gene and the reverse transcriptase SuperScript IV. The method was validated in a series of samples, provided robust amplification for samples with IS values down to 0.00072% and is already routinely used in the laboratory.