Titelaufnahme

Titel
Einfluss der mRNA Stabilität auf Stressantwortmechanismen in Mesothelzellen im Modell der Peritonealdialyse
Weitere Titel
Influence of mRNA stability on stress response in mesothelial cells in the model of peritoneal dialysis
AutorInnenDürauer, Sophie
GutachterEnzinger, Sabine
Erschienen2018
Datum der AbgabeJuni 2018
SpracheDeutsch
DokumenttypBachelorarbeit
Schlagwörter (DE)Mesothelzellen / mRNA Stabilität / Peritonealdialyse / qPCR / Stressantwortmechanismen
Schlagwörter (EN)mesothelial cells / mRNA stability / peritoneal dialysis / qPCR / stress response mechanisms
Zugriffsbeschränkung
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Die Peritonealdialyse (PD) stellt eine Form der Nierenersatztherapie dar, die vom Patienten bzw. der Patientin mit terminalem Nierenversagen selbstständig durchgeführt werden kann. Durch ihre Zusammensetzung schädigen die verwendeten Peritonealdialyseflüssigkeiten (PDF) peritoneale Mesothelzellen, induzieren gleichzeitig aber auch Stressantwortmechanismen dieser Zellen. Mit steigender Behandlungsdauer führt diese Therapie zu einer Verminderung dieser zytoprotektiven Mechanismen. In anderen Zellmodellen konnte bereits ein Einfluss der mRNA Stabilität auf die zelluläre Stressantwort beobachtet werden. In dieser Bachelorarbeit wurde Expression, Stabilität und Abbau der mRNA von Stressantwortproteinen in Mesothelzellen im in-vitro Modell der PD untersucht.

Hierfür wurden humane immortalisierte Mesothelzellen (MeT-5A) in Zellkulturversuchen einer PDF-Exposition ausgesetzt. Um die mRNA Stabilität beurteilen zu können wurde der Transkriptionsinhibitor Actinomycin D (Act D) eingesetzt. Die Abundanz von Proteinen wurde mittels Western Blot, die von mRNA mittels qPCR analysiert. Zusätzlich wurde eine Methode zur sequenziellen Isolation von RNA und Proteinen aus derselben Probe mittels Acetonpräzipitation etabliert.

Es konnte gezeigt werden, dass bei Acetonpräzipitation von Protein nach vorheriger RNA-Isolation geringere Proteinkonzentrationen vorhanden waren, als bei Verwendung eines Lysepuffers, der für die Isolation von Proteinen aus Zellen optimiert ist. Die spezifische Detektion von Proteinen mittels Western Blot war trotzdem möglich und ergab vergleichbare biologische Informationen.

In der Analyse der mRNA Stabilität und ihrer Kinetik konnte keine Veränderung durch Behandlung mit PD im Vergleich zum Gold-Standard der Hitzeschockantwort, Hitzestimulation, festgestellt werden. Es konnte jedoch erstmals gezeigt werden, dass die Expressionslevels der untersuchten mRNAs von Hitzeschockproteinen bei PDF-Exposition unter den Werten bei Hitzestimulation lagen. Durch Zugabe von Alanyl-Glutamin (AlaGln) zur PDF konnte zwar eine Erhöhung der mRNA Expressionslevel detektiert, jedoch keine Veränderung des Abbaus festgestellt werden. Diese Erkenntnisse deuten darauf hin, dass AlaGln in immortalisierten Mesothelzellen im Modell der PD die mRNA Stabilität nicht beeinflusst.

Zusammenfassung (Englisch)

Peritoneal dialysis is a form of renal replacement therapy with dialysis which can be performed independently by the patient with end-stage renal failure. Due to their specific composition, peritoneal dialysis fluids (PDF) harm peritoneal mesothelial cells but at the same time induce cellular stress response mechanisms in these cells. Over time, treatment with this therapy leads to a reduction of these cytoprotective mechanisms. In other cell models, an influence of mRNA stability on the cellular stress response has previously been described. In this bachelor thesis, expression, stability and degradation of mRNA of stress response proteins in mesothelial cells in the in-vitro model of PD was investigated.

For this purpose, human immortalized mesothelial cells (MeT-5A) were exposed to PDF in cell culture experiments. To determine mRNA stability, the transcription inhibitor Actinomycin D (Act D) was added to the cells. The abundance of proteins was analyzed using Western blot and mRNA was analyzed by qPCR. In addition, a method for sequential isolation of RNA and proteins from the same sample by acetone precipitation was established.

Acetone precipitation of proteins after RNA isolation yielded lower total protein concentrations compared with the results of samples lysed in a buffer optimized for protein isolation from cells. Nevertheless, the specific detection of proteins by Western blot was possible with comparable biological information.

The analysis of mRNA stability and its kinetics, showed no significant changes between exposure to PDF compared to the gold standard for heat shock responses, heat stimulation. This study shows for the first time that expression levels of the investigated heat shock protein mRNAs were in each case below the values of heat stimulation. By adding alanyl-glutamine (AlaGln) to the treatments an increase in mRNA expression was detected, but no changes in the kinetics of the degradation process. These findings indicate that AlaGln does not affect mRNA stability in immortalized mesothelial cells in this model of PD.

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