Titelaufnahme

Titel
Expression von ERK und JNK als Fusionsproteine und Einsatz als Substrat für Phosphataseassays in Endothelzellextrakten nach Behandlung mit Ropivacain.
Weitere Titel
Expression of fusion proteins ERK and JNK as substrates for quantification of the phosphatase-activity in HUVEC-extracts after ropivacaine treatment.
AutorInnenMekiri, Meriem
GutachterBauer-Rupprecht, Susanne
Erschienen2018
Datum der AbgabeJuni 2018
SpracheDeutsch
DokumenttypBachelorarbeit
Schlagwörter (DE)Dexamethason / Mitogen aktivierte Protein (MAP)Kinasen / Reaktive Sauerstoffgruppen (ROS) / Ropivacain
Schlagwörter (EN)Dexamethasone / Mitogen activated protein (MAP)kinases / Reactive oxgen spiecies (ROS) / Ropivacaine
Zugriffsbeschränkung
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Diese Arbeit befasst sich mit der empirischen Erforschung des Lokalanästhetikums Ropivacain und des Glucocorticoids Dexamethason hinsichtlich ihrer Auswirkung auf die Signalwege der Mitogen aktivierten Protein-Kinasen (MAPKinasen) ERK und JNK. Im Speziellen wird die Expression und Isolierung der Kinasen ERK und JNK als GST-Fusionsproteine mithilfe von bl21-DE3 und xl1 blue kompetenten E.coli beschrieben, sowie die Etablierung von quantitativen Assays für spezifische MAPKinase Phosphatasen.

Die verwendeten Methoden umfassen Plasmidtransformation, Kultivierung der transformierten Bakterien und Reinigung der Fusionsproteine, in vitro Phosphorylierung sowie eine anschließende ELISA-basierte Quantifizierung der Phosphataseaktivität. Die Phosphataseaktivität wurde in Zellextrakten von humanen Endothelzellen (HUVEC) gemessen, die zuvor mit dem Lokalanästhetikum Ropivacain bzw. einer Kombination von Ropivacain mit Dexamethason behandelt worden waren. Diese Arbeit ist Teil einer Studie an der Medizinischen Universität Wien, die den Einfluss von Ropivacain auf verschiedene Phosphataseaktivitäten untersucht.

Die statistische Auswertung der erworbenen Daten lässt sich wie folgt interpretieren: Ropivacain und Dexamethason führen durch eine Aktivierung spezifischer Phosphatasen innerhalb von 5 Minuten zu einer Herabregulation der ERK-Aktivität. Eine Signifikanz ist mit einer geringen Überschreitung des F-Werts um 0,0132 nicht gegeben, da der Stichprobenumfang mit n=4 nicht ausreichend war. JNK konnte zwar als GST Fusionsprotein gereinigt werden, allerdings aufgrund seiner Instabilität nicht näher untersucht werden.

Zusammenfassung (Englisch)

This thesis deals with the local anesthetic ropivacaine and the glucocorticoide dexamethasone regarding their impact on the signal pathways of mitogen activated protein (MAP)kinases ERK and JNK. The practical work included the expression and isolation of the fusion proteins ERK and JNK as well as their upstream activating kinases MEK1, MKK4 and MKK7 from the e.coli strains bl21-DE3 and xl1 blue.

The used methods comprise plasmid transformation, expression in e.coli strains and isolation of fusion proteins, in vitro phosphorylation of MAPkinases as well as an ELISA based quantification of the specific phosphatase activity. The phosphatase activity was assessed in extracts from human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) after treatment with ropivacaine and dexamethasone.

In summary, the results suggest that ropivacaine causes a downregulation of activated ERK within the first 5 minutes, caused by the activation of specific phosphatases. However, statistical significance could not be reached due to small sample size (n=4) (F-value exceeded for 0,0132). Because of proteolytic activity the purified GST-JNK couldn’t be used for further examination in phosphatase-assays.