Titelaufnahme

Titel
Vergleich manueller, semiautomatisierter und automatisierter Methoden zur Quantifizierung von Sklerostin in Gewebeschnitten von Mausknochen.
Weitere Titel
Comparison of manual, semi-automated and automated methods for the quantification of sclerostin in tissue sections of mouse bones.
AutorInnenRieschl, Linda
GutachterGstinig, Karin
Erschienen2018
Datum der AbgabeJuni 2018
SpracheDeutsch
DokumenttypBachelorarbeit
Schlagwörter (DE)Sklerostin-positive Osteozyten / Immunhistochemie / „TissueFAXSTM“ / „Osteomeasure“ / Gesichtsfeldmethode / C57BL/6J Mäuse
Schlagwörter (EN)sclerostin-positive osteocytes / immunohistochemistry / "TissueFAXSTM" / "Osteomeasure" / "the method of the field of view" / C57BL/6J mice
Zugriffsbeschränkung
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Das Protein Sklerostin ist ein Antagonist der knochenaufbauenden Zellen, der Osteoblasten. Indem Sklerostin an den Wnt/beta-catenin Signaltransduktionsweg bindet, inhibiert es den Knochenaufbau. Aufgrund der Wichtigkeit von Sklerostin, welche sich durch die zukünftige Therapiemöglichkeit von Knochenerkrankungen ergibt, wäre eine automatisierte Quantifizierungsmethode der Sklerostin-Expression in Gewebeschnitten von Knochen von Vorteil.

Ziel war es, eine solche Methode zu etablieren und vier verschiedene Quantifizierungsmethoden, darunter die automatisierte Methode, auf ihre Gleichwertigkeit zu überprüfen. Bei den vier Quantifizierungsmethoden handelte es sich um eine manuelle Methode, um zwei semiautomatisierte Methoden und um eine automatisierte Methode. Weiters sollte erforscht werden, ob sich in unterschiedlichen Skelettregionen unterschiedliche Sklerostin-Expressionen wiederspiegeln.

Aus den Analyseergebnissen war ersichtlich, dass die manuelle Gesichtsfeldmethode nicht mit den beiden semiautomatisierten Methoden übereinstimmt. Die Gesichtsfeldmethode war weder mit der Methode „Osteomeasure“, noch mit der Methode „TissueFAXSTM“ manuell gleichwertig zu setzten. Weiters lässt sich feststellen, dass auch die Gleichwertigkeit zwischen der Gesichtsfeldmethode und der Methode „TissueFAXSTM“ automatisiert in Frage zu stellen war, da die automatisierte Methode eine sehr starke Variabilität aufwies. Letztendlich kann gesagt werden, dass zehn Gesichtsfelder nicht repräsentativ für den gesamten kortikalen Knochen waren. Der Vergleich der Ergebnisse der Methoden „Osteomeasure“, „TissueFAXSTM“ manuell und „TissueFAXSTM“ automatisiert ergab, dass diese Methoden als gleichwertig zu betrachten sind.

Außerdem muss gesagt werden, dass einerseits kein signifikanter Unterschied zwischen den Knochen Femur und Tibia eines Individuums des Mausstammes C57BL hinsichtlich ihrer Gesamtanzahl an Osteozyten bezogen auf 1mm² vorlag. Es war jedoch andererseits ein signifikanter Unterschied zwischen Femur und Tibia hinsichtlich der Anzahl an Sklerostin-positiven Osteozyten bezogen auf 1mm² zu erkennen. Dass sich die Sklerostin-Expression in verschiedenen Skelettregionen unterschiedlich darstellte, ist eine neue Erkenntnis, welche für weitere Forschungsprojekte von Vorteil ist.

Die Etablierung einer vollständig automatisierten Methode stellte sich als schwierig heraus. Über den Grad der Automatisierung der als automatisiert angesehenen „TissueFAXSTM“ Methode ließ sich diskutieren. Auch die Analyse dieser Methode wurde stark von der ausführenden Person beeinflusst, wodurch nicht von einer vollständigen Automatisierung gesprochen werden kann. Diese Methode ist auf jeden Fall noch weiter zu entwickeln und zu verbessern.

An der Etablierung einer automatisierten Quantifizierungsmethode für Sklerostin in Knochenpräparaten muss noch weiter geforscht werden. Die Gleichwertigkeit dreier Quantifizierungsmethoden konnte in dieser Arbeit nachgewiesen werden. Dies ist der erste Schritt zur Verbesserung der Quantifizierung von Sklerostin.

Zusammenfassung (Englisch)

The protein sclerostin is an antagonist of osteoblasts. It decreases bone formation by inhibiting the wnt/beta-catenin signaling pathway. In terms of the possibility to treat bone diseases, an automated quantification method of sclerostin expression in bone tissue sections would be beneficial.

The aim of this project was to establish such a method and to verify the equivalence of four different quantification methods, including the automated method. The four methods consisted of a manual method, two semi-automated methods and one automated method. Another aim was to investigate whether different sclerostin expressions are found in different skeletal regions.

The results of the analysis showed that the manual method, which is “the method of the field of view”, cannot be compared with the semi-automated methods of “Osteomeasure” and “TissueFAXSTM” manual. Furthermore, the equivalence between the field of view method and the “TissueFAXSTM” automated method had to be questioned because the automated method had a very high variability. Finally, it can be said that ten fields of view were not representative for the total cortical bone. The comparison of the results of the methods “Osteomeasure”, “TissueFAXSTM” manual and “TissueFAXSTM” automated showed that these methods can be regarded as equivalent.

On the one hand, there was no significant difference between the bones femur and tibia of an individual of the mouse strain C57BL in terms of their total number of osteocytes relative to 1mm². On the other hand, there was a significant difference between the bones femur and tibia in the number of sclerostin-positive osteocytes relative to 1mm². The fact that the sclerostin-expression differs in different skeletal regions was a new finding, which is of relevance for further research projects.

The establishment of a completely automated method turned out to be difficult. The level of automatization of the automated “TissueFAXSTM” method can be discussed. The analysis of this method was strongly influenced by the executing person. This is the reason why it is not a complete automatization. This method still needs to be developed and improved.

Further research is needed to establish an automated quantification method for sclerostin in bone preparations. However, the equivalence of three quantification methods could be demonstrated in this work. This is the first step in improving the quantification of sclerostin.