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Title
Evaluation des BMI-1 Inhibitors PTC-028 auf die in vitro Osteogenese von mesenchymalen Knochenmarksstromazellen
Additional Titles
Evaluation of the BMI-1 Inhibitor PTC-028 on the in vitro osteogenesis of mesenchymal bone marrow stromal cells
AuthorRoiß, Johanna Romana
Thesis advisorMilosavljevic, Dejan
Published2018
Date of SubmissionJune 2018
LanguageGerman
Document typeBachelor Thesis
Keywords (DE)Multiples Myelom / Knochenerkrankung / BMI-1 / PTC-028
Keywords (EN)Multiple Myeloma / bone disease / BMI-1 / PTC-028
Restriction-Information
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Classification
Abstract (German)

Hintergrund:

Das Multiple Myelom (MM) ist trotz der Etablierung neuer Therapien eine großteils unheilbare Erkrankung. Da das Mikromilieu im Knochenmark durch die Infiltration der Myelomzellen moduliert wird, ist das Miteinbeziehen der direkten Umgebung der malignen Plasmazellen bei der Austestung neuer Wirkstoffe erforderlich. Das polycomb complex Protein BMI-1, welches im Myelom überexprimiert wird, ist seit Längerem als attraktives Therapieziel identifiziert. Mittlerweile wurden erste BMI-1 spezifische Inhibitoren entwickelt, um diese Therapiestrategie zu verwirklichen. In der vorliegenden Arbeit wurde daher die Wirkung des BMI-1 Inhibitors PTC-028 auf die Osteogenese von mesenchymalen Knochenmarks-stromazellen (BMSCs) in vitro abgeklärt. Zudem wurde der Einfluss des Inhibitors auf die Viabilität von elf Myelomzelllinien untersucht.

Material & Methoden:

Zunächst wurde die anti-Myelomaktivität von PTC-028 mittels Viabilitätsassays in vitro untersucht. Anschließend wurden BMSCs unter PTC-028 Behandlung zu Osteoblasten differenziert und dessen Effekt mit Hilfe von Viabilitätsassays, Zellzyklusanalysen, Alkaline Phosphatase (ALP) Aktivitätsbestimmungen, quantitativen PCRs und Mineralisierungs- sowie Kollagenfärbungen evaluiert.

Ergebnisse:

PTC-028 zeigte eine dosisabhängige stark inhibierende Wirkung auf alle getesteten MM-Zellen, jedoch nur einen minimalen Effekt auf die Viabilität von BMSCs. Während der Osteoblastendifferenzierung wurde konzentrationsabhängig ein signifikanter Anstieg der osteoblastenspezifischen ALP Aktivität über 14 Tage hinweg festgestellt. Des Weiteren konnte eine signifikante Hochregulierung des ALPL und Osx Genes an Tag 7 der Differenzierung nachgewiesen werden. Außerdem konnte eine Überexpression von DKK-1 festgestellt werden, was auf eine erfolgreiche BMI-1 Inhibierung hindeutet und zeigt, dass die Hochregulierung von DKK-1 im vorliegenden Versuchsdesign keine suppressive Wirkung auf die Osteoblastenentwicklung hat. Hinsichtlich der Ausdifferenzierung von BMSCs wurde eine erhöhte Mineralisierungsaktivität und Kollagenproduktion nach 28 Tagen beobachtet. Aufgrund dieser Ergebnisse wird von einem dosisabhängigen positiven Effekt von PTC-028 auf die Entwicklung von Osteoblasten ausgegangen.

Konklusion:

Insgesamt konnte mit PTC-028 eine starke, selektive anti-Myelomaktivität sowie ein positiver Effekt auf die Differenzierung von Osteoblasten nachgewiesen werden. Somit konnte in dieser Arbeit das Potential des BMI-1 Inhibitors PTC-028 als vielversprechendes neuartiges Medikament zur Behandlung des Multiplen Myeloms bestätigt werden.

Abstract (English)

Background:

Despite the establishment of new therapies such as immunomodulatory agents or proteasome inhibitors, multiple myeloma (MM) remains incurable in the majority of patients. The infiltration of MM-cells leads to an uncoupling of the bone marrow compartment and therefore new drug development efforts should not only aim to reduce the tumor mass, but also to stabilize bone metabolism. BMI-1 has been identified as an interesting therapeutic target in various human malignancies, but until recently there was a lack of clinical grade BMI-1 inhibitors. The development of these novel agents, e.g. PTC-028, raises hope to target a so far undruggable key gene of human tumorigenesis. In this thesis, the effect of PTC-028 on the in vitro osteogenesis of human bone marrow stromal cells (BMSCs) was evaluated. In addition, the inhibitor’s effect on the viability of different myeloma cell lines was investigated.

Material & Methods:

The anti-myeloma activity of PTC-028 was evaluated in vitro using viability assays. Subsequently the effect of PTC-028 during osteoblast development was investigated by viability testing, cell cycle analysis, alkaline phosphatase (ALP) activity assay, quantitative PCR and mineralization and collagen staining.

Results:

PTC-028 showed a dose-dependent inhibitory effect on all tested MM cell lines but did not affect the viability of human BMSCs at effective anti-MM concentrations. PTC-028 treatment during osteogenesis led to a significant increase of ALP activity over 14 days in a dose-dependent manner. Additionally, a significant up-regulation of ALPL gene expression, as well as the osteoblastic transcription factor Osx was detected on day 7 of differentiation. We also observed overexpression of DKK-1, indicating successful BMI-1 inhibition on the one hand, and on the other hand, showing that up-regulation of DKK-1 has no suppressive effect on the development of osteoblasts in this setting. Thus, other PTC-028 mediated osteoblast-stimulating mechanisms likely overrule the inhibitory activity of DKK-1. Regarding late stage differentiation, we observed increased matrix mineralization and collagen production after 28 days. Based on these results, a dose-dependent positive effect of PTC-028 on the development of osteoblasts is assumed.

Conclusion:

In sum, PTC-028 showed potent anti-myeloma activity as well as a positive effect on the differentiation of osteoblasts. Thus, the results of this thesis strongly support the potential of PTC-028 as promising novel agent to overcome the current limitations of established anti-myeloma therapeutics.