Bibliographic Metadata

Title
Redoxstatus, Zellzahl und Genexpression in HTR8/SVneo Zellen nach Treatment mit Methylquecksilber
Additional Titles
Redox State, Cell Number and Gene Expression in HTR8/SVneo Cells Treated with Methylmercury
AuthorKaudela, Theresa-Maria
Thesis advisorStefanik, Veronika
Published2018
Date of SubmissionJune 2018
LanguageEnglish
Document typeBachelor Thesis
Keywords (DE)Genknockdown / Glutathionsystem / HTR8/SVneo Zellen / Methylquecksilber
Keywords (EN)Gene Knockdown / Glutathione System / HTR8/SVneo Cells / Methylmercury
Restriction-Information
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Classification
Abstract (German)

Die Eigenschaft von Methylquecksilber (MeHg), zelluläre Barrieren zu passieren, ist auf den Mechanismus molecular mimicry zurückzuführen. Die Plazentabarriere als auch die Bluthirnschranke stellen keine Ausnahmen dar, darin resultierend, dass der Fetus den schädlichen Mechanismen von Quecksilber (Hg) ausgesetzt wird. Da Hg in der Fenton-Reaktion reagiert, ist es ein Auslöser von oxidativem Stress, welcher Lipide, Proteine und DNA schädigen kann, sollte die Zelle ihn nicht durch ihre antioxidativen Systeme bekämpfen können. Das wichtigste antioxidative System im menschlichen Körper ist das Glutathionsystem. Es spielt eine große Rolle in der Detoxifikation von reaktiven Sauer-stoffspezies und in der Exkretion von Xenobiotika.

In dieser Studie wurden HTR8/SVneo Zellen als Modell für Trophoblasten aus der menschlichen Plazenta des ersten Trimesters verwendet, um zu untersuchen, wie sich 0,9 und 1,8 µM MeHg über 14 h auf den Redoxstatus, die Zellzahl, Genexpression (GCLC, GCLM, SLC7A5, ABCC1, NFE2L2) und intrazelluläre Akkumulation von totalem Hg auswirken. Die Experimente wurden in Zellen ohne siRNA mediiertem Genknockdown und mit Knockdown von GCLM, GPx1, GR und Nrf2 durchgeführt.

HTR8/SVneo Zellen, die mit 1,8 µM MeHg behandelt wurden, zeigen eine Reduktion der Zellzahl um 30% und akkumulieren doppelt so viel totales Hg wie Zellen, die mit 0,9 µM behandelt wurden. Unbehandelte Zellen zeigen eine mittlere Konzentration von 11±4 µmol totales Glutathion per Zelle, während Zellen unter 0,9 µM Treatment einen Trend zu einer niedrigeren totalen Glutathionkonzentration zeigen (10±1 µmol/Zelle). Nach dem Knockdown von GPx1 respektive GR zeigen die Zellen keine Veränderungen im Redoxstatus. Zellen mit GR Knockdown beinhalten ungefähr doppelt so viel totales Glutathion, GSH und GSSG verglichen mit Kontrollen oder Zellen mit GPx1 Knockdown. Des Weiteren akkumulieren sie ungefähr das gleiche Level an totalem Hg wie Kontrollen. Der Knockdown von GPx1 resultiert in einer höheren Akkumulation. Wegen einer zu geringen Stichprobenzahl wurde jedoch davon abgesehen, eine induktivstatistische Auswertung durchzuführen.

Das Treatment mit 1,8 µM MeHg reduziert die Zellzahl nach GCLM Knockdown um ca. 30% und nach Nrf2 Knockdown um 62%. Ungeachtet des Knockdowns akkumulieren Zellen, die mit dieser MeHg-Dosis behandelt wurden, doppelt so viel totales Hg verglichen mit Zellen, die mit 0,9 µM behandelt wurden. Zellen mit GCLM Knockdown akkumulieren weniger, Zellen mit Nrf2 Knockdown akkumulieren mehr totales Hg als Kontrollen. Die untersuchte Genexpression zeigt nach dem Knockdown von GCLM respektive Nrf2 Trends zu Veränderungen. Diese sind jedoch statistisch nicht signifikant.

Die generierten Daten lassen jedoch keine klare Antwort auf die Forschungsfragen zu, weil einige Ergebnisse nicht vollständig vorliegen und die Stichprobengröße in vielen Fällen zu gering ist. Dadurch kann die Alternativhypothese H1 weder angenommen noch verworfen werden. Um allumfassende Daten zu generieren, sollten fehlende Ergebnisse aus Experimenten nachgeholt werden. Somit können ausreichend Daten für induktiv-statistische Tests dargelegt werden, was zu einem besseren Verständnis der schädigenden Effekte von Hg in der Plazenta führen soll.

Abstract (English)

Methylmercury (MeHg) is able to pass over cellular barriers using a mechanism called molecular mimicry. The placental barrier as well as the blood-brain barrier are no exceptions, leaving the developing fetus exposed to the harming effects of mercury (Hg). Due to its ability to enter the Fenton’s Reaction, Hg induces oxidative stress which causes oxidation of lipids, proteins and DNA if the cells cannot counteract through their antioxidative systems. The primary antioxidative system is the glutathione system, playing a major role in detoxification of reactive oxygen species and excretion of xenobiotics.

In this study HTR8/SVneo cells, a model for human first trimester trophoblasts, were used to determine the effects of 0.9 and 1.8 µM MeHg treatment for 14 hrs on the redox state, cell number, expression of genes encoding for GCLC, GCLM, LAT1, MRP1 and Nrf2 and on the intracellular accumulation of total Hg. These experiments were conducted in cells without siRNA mediated gene knockdown as well as in cells with knockdown of GCLM, GPx1, GR and Nrf2, respectively.

It was found that HTR8/SVneo cells treated with 1.8 µM MeHg show a reduction in cell number of 30% and accumulate twice as much total Hg intracellular than cells treated with 0.9 µM MeHg. Non-treated cells contain a mean concentration of 11±4 µmol total glutathione/cell whereas cells treated with 0.9 µM MeHg show a trend for a lower total glutathione concentration (10±1 µmol/cell). Upon knockdown of GPx1 respectively GR, no alterations in the redox state could get detected. GR knockdown cells contain about twice as much total glutathione, GSH and GSSG compared to controls or GPx1 knockdown cells. GR knockdown cells accumulate the same level of total Hg as controls, GPx1 knockdown results in a higher accumulation. However, due to a too small sample size, it was desisted from conducting inductive statistical analysis.

The treatment with 1.8 µM MeHg reduces cell numbers upon GCLM knockdown by about 30% and upon Nrf2 knockdown by 62%. Irrespective of the knockdown, cells treated with this dosage of MeHg accumulate twice as much total Hg intracellular than cells treated with 0.9 µM. GCLM knockdown cells accumulate less, Nrf2 knockdown cells accumulate more total Hg than controls. Gene expression upon GCLM respectively Nrf2 knockdown shows trends towards alterations, but no changes were statistically significant.

However, the available results cannot provide a clear answer to the research questions due to incoherent results and too small sample sizes. Therefore, the alternative research hypothesis H1 can neither get accepted nor ruled out. For generating all-encompassing data, missing results from experiments should be amended. In this way, sufficient data for conducting inductive statistical analysis can be provided what will lead to a better understanding of the harming effects of Hg on the placenta.