Bibliographic Metadata

Title
Überexpression von Multidrug-Effluxpumpen : Genexpressionsanalyse von Candida glabrata CgPDR1 Mutanten
Additional Titles
Overexpression of Multidrug-Efflux Pumps Analysis of Gene Expression of Candida glabrata CgPDR1 Mutants
AuthorKriz, Richard
Thesis advisorBauer-Mitlinger, Susanne
Published2018
Date of SubmissionJune 2018
LanguageGerman
Document typeBachelor Thesis
Keywords (DE)Genexpressionsanalyse / Drug-Effluxpumpen / CgPDR1 / Next Generation Sequencing / Azolresistenz
Keywords (EN)analysis of gene expression / drug-efflux pumps / CgPDR1 / next generation sequencing / azole resistance
Restriction-Information
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Classification
Abstract (German)

CgPDR1 ist ein Transkriptionsfaktor für die Drug-Effluxpumpen CDR1, CDR2 und SNQ2. Gain-of-Function Mutationen in CgPDR1 sind mit einer konstitutiv aktiven Genexpression jener Effluxpumpen beschrieben. Dieser Resistenzmechanismus wird speziell mit der Azolresistenz assoziiert und scheint eine der wichtigsten molekularen Ursachen für eine verminderte Empfindlichkeit gegen Azole bei C. glabrata zu sein.

In dieser empirischen Studie wurden 15 C. glabrata Isolate mit einer Mutation im Transkriptionsfaktor CgPDR1 auf eine Überexpression der Drug-Effluxpumpen CDR1, CDR2 und SNQ2 untersucht. Die Stichprobe der CgPDR1 Mutanten wurde einer Kontrollpopulation mit fünf sensiblen und fünf azolresistenten Stämmen ohne Mutation in CgPDR1 gegenübergestellt. Vor der RNA-Extraktion wurden diese 25 Isolate simultan in zwei Ansätzen inkubiert, wobei ein Ansatz eine Fluconazolkonzentration von 200 µg/ml beinhaltete. Anschließend wurde die Genexpression der Drug-Effluxpumpen CDR1, CDR2 und SNQ2 mittels einer quantitativen Real-Time-PCR im Triplikat quantifiziert.

Zwischen CgPDR1 Mutanten und Nichtmutanten konnte ein signifikanter Unterschied in der Genexpression von CDR1, CDR2 als auch SNQ2 nachgewiesen werden. Die CDR1 Expressionsrate bei den Kontrollstämmen lag im Mittel bei 2,3 ± 1,2 SD im Vergleich zum Kontrollstamm CBS138. Bei den CgPDR1 Mutanten lag die mittlere Expressionsrate bei 32,9 ± 29,8 SD. Auch die Expressionsraten von CDR2 mit x̅ = 8,6 ± 4,6 SD gegen x̅ = 43,42 ± 33,69 SD und SNQ2 mit x̅ = 1,9 ± 0,7 SD gegen x̅ = 4,17 ± 1,92 SD wiesen signifikante Unterschiede auf.

In dieser Studie wurde eine große Stichprobe von C. glabrata sowohl auf Mutationen in CgPDR1, als auch auf Genexpressionsänderungen der Drug-Effluxpumpen CDR1, CDR2 und SNQ2 untersucht. Dadurch konnte zusätzlich zur Entdeckung neuer Mutationen deren Auswirkungen auf die Genexpression von Drug-Effluxpumpen analysiert werden. Es konnte eine klare Assoziation zwischen CgPDR1 Mutationen und Überexpression von Drug-Effluxpumpen bestätigt werden. Da fast alle in dieser Studie untersuchten Isolate mit einer Mutation in CgPDR1 eine Überexpression von CDR1, CDR2 und SNQ2 aufweisen, scheint dieser Resistenzmechanismus eine der wichtigsten Ursachen für das Auftreten azolresistenter C. glabrata Isolate zu sein. Die Sequenzierung von CgPDR1 stellt somit eine einfache, aber essentielle Methode dar, um eine Azolresistenz von C. glabrata molekularbiologisch zu erfassen.

Abstract (English)

CgPDR1 is the transcription factor for the drug-efflux pumps CDR1, CDR2 and SNQ2. Gain-of-function mutations in CgPDR1 are described with constitutively active gene expression of those efflux pumps. This mechanism of resistance is specifically associated with azole resistance and seems to be one of the major molecular causes of reduced azole susceptibility in C. glabrata.

In this empirical study, 15 C. glabrata isolates with a mutation in the transcription factor CgPDR1 were investigated for overexpression of the drug-efflux pumps CDR1, CDR2 and SNQ2. The sample of CgPDR1 mutants was compared to a control population with five susceptible and five azole resistant strains without mutation in CgPDR1. Prior to RNA extraction, these 25 isolates were incubated simultaneously in two batches, with one batch containing a fluconazole concentration of 200 μg/ml. Subsequently, the gene expression of the drug-efflux pumps CDR1, CDR2 and SNQ2 was quantified in triplicate by quantitative real-time PCR.

A significant difference in gene expression of CDR1, CDR2 and SNQ2 was detected between CgPDR1 mutants and CgPDR1 non-mutants. The CDR1 expression rate in the control strains averaged 2.3 ± 1.2 SD compared to the control strain CBS138. For the CgPDR1 mutants the mean gene expression was 32.9 ± 29.8 SD. The gene expression of CDR2 (x̅ = 8.6 ± 4.6 SD; x̅ = 43.42 ± 33.69 SD) and SNQ2 (x̅ = 1.9 ± 0.7 SD; x̅ = 4.17 ± 1.92 SD) showed significant differences as well.

In this study, a large population of C. glabrata was examined for mutations in CgPDR1 as well as for gene expression changes of the drug-efflux pumps CDR1, CDR2 and SNQ2. Thus, in addition to the discovery of new mutations, their effects on gene expression of drug-efflux pumps were analysed. A clear association between CgPDR1 mutations and overexpression of drug-efflux pumps was confirmed. Since an overexpression of drug-efflux pumps could be detected in most of the CgPDR1 mutants analysed in this study, this mechanism of resistance seems to be a major cause for azole resistance in C. glabrata. Thus, the sequencing of CgPDR1 is a simple, but essential method to determine the molecular cause for azole resistance in many C. glabrata isolates.