Titelaufnahme

Titel
Prozess zur Herstellung, Aufreinigung und Abfüllung von Fibroblast growth factor 2 mittels Escherichia coli
Weitere Titel
The process of manufacturing, purifying and aseptic filling of fibroblast growth factor 2 in Escherichia coli
AutorInnenHeindl, Konrad
GutachterMaurer, Michael ; Bliem, Rudolf Friedrich
Erschienen2018
Datum der AbgabeJuni 2018
SpracheDeutsch
DokumenttypBachelorarbeit
Schlagwörter (DE)Escherichia / coli / FGF2 / FGF-2 / fibroblast / growth factor / Filtration / Tiefen
Schlagwörter (EN)Escherichia / coli / FGF2 / FGF-2 / fibroblast / growth factor / Filtration / depth
Zugriffsbeschränkung
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Das Ziel der Bachelorarbeit ist es, einen skalierbaren und theoretisch realisierbaren Bioprozess zur Herstellung des rekombinanten humanen Wachstumsfaktor 2 zu erarbeiten. Dieser intrazellulär exprimierende Wachstumsfaktor steuert in adulten Organismen bestimmte gewebereparierende Prozesse, weshalb eine Anwendung sowohl in der kosmetischen /ästhetischen Chirurgie, als auch in der Behandlung von peripheren arteriellen Verschlusskrankheiten möglich wäre.

Realisiert wurde dieses Projekt indem es in vierzehn Teilgebiete gegliedert und jedes einzelne Segment von einem anderen Studenten, unter kontinuierlicher Absprache innerhalb der Gruppe, ausgearbeitet wurde.

Als Produktionshost wurde ein bestimmter Escherichia Coli-Stamm ausgewählt, welcher eine gute, reproduzierbare Ausbeute gewährleistet. Nachdem die Batch- oder Fedbatchfermentation erfolgreich abgelaufen ist, wird mittels Zentrifugation die Biomasse vom Überstand abgetrennt. Durch eine Hochdruckhomogenisation wird das Produkt gemeinsam mit Zellbestandteilen in das umgebende Medium abgegeben. Nach erneut durchgeführter Zentrifugation liegt das gesuchte Protein nun im geklärten Puffer vor und muss nun von kleineren Verunreinigungen und unerwünschten Präzipitaten abgetrennt werden.

Um sicherzustellen, dass das vorliegende Produkt/Puffergemisch nicht durch Oxidation geschädigt wird, läuft die gesamte Tiefen- und 0,22 μm-Filtration ohne Luftkontakt mittels Stickstoffüberlagerung ab. Die zwischen den beiden 200 L Sammeltanks geschaltete Tiefenfiltration ist modular aufgebaut und könnte eine eventuell benötigte Produktionssteigerung problemlos unterstützen. Damit es während der beiden Filtrationsschritte zu keinen unerwünschten Effekten aufgrund von Pumpenstößen kommen kann, wurde für den Transfer komplett auf Pumpen verzichtet. Der notwendige Filtrationsdruck wird nur durch den im Tank angelegten Stickstoffdruck erzeugt.

Nach erfolgreicher Filtration wird das Produkt in mehrere Single-Use Bags abgefüllt, welche eine Zwischenlagerung und einen einfachen Transport ermöglichen. Aufgereinigt wird anschließend über eine Anionenaustauschchromatographie und aufkonzentriert mittels Ultradiafiltration.

Da es sich hierbei um einen theoretischen pharmazeutischen Prozess handelt, mussten verschiedene, qualitätsrelevante Dokumente erstellt werden um eine gleichbleibende Qualität sowie Nachverfolgbarkeit zu gewährleisten. Basis dieser Unit-Operation „Filtration“ bildet das mithilfe der Software „RI-CAD“ erstellte R&I Schema. Dort sind alle Gerätschaften, Leitungen sowie Ventile und Messmittel abgebildet, welche für eine erfolgreiche Filtration notwendig sind. Damit es geregelte Vorgaben bezüglich der Bedienung und Dokumentation gibt, wurde weiters eine Standard Operating Procedure für die Handhabung der Tiefenfiltration sowie ein Master Batch Record erstellt, welcher die wichtigsten Prozessdaten zur Filtration beinhaltet.

Alle Teilgebiete zusammengefasst, ergeben dadurch einen strukturierten Gesamtprozess zur Erzeugung des gewünschten, rekombinanten Proteins.

Zusammenfassung (Englisch)

After the fed batch-production of the protein "fibroblast growth factor 2" by an Escherichia coli fermentation and cell disruption caused by homogenization, the supernatant was clarified by a plate separator and is now ready for further processing. Therefore, remaining cells and cell components must be effectively separated by a depth-filtration and a 0,22μm main filter. STAX capsules are ideally suited for this application, provide stable filtration results batch to batch and cover a volume range from 50L up to 20.000L. After the filtration steps have been successfully carried out, the purification of the product will be started with a subsequent anionexchangerchromatography step. This SOP describes the storage, the correct assembly, a necessary WFI pre-wash and the disposal of this single-use STAX depth-filters to ensure a successful depth-filtraion.