Bibliographic Metadata

Title
Biopharmazeutischer Herstellungsprozess von humanem Serumalbumin mit Pichia pastoris - Bereitung des Inokulums
Additional Titles
Biopharmaceutical Manufacturing Process of Human Serum Albumine with Pichia pastoris - Preparation of the Inoculum
AuthorNovak, Gregor
Thesis advisorBliem, Rudolf Friedrich ; Maurer, Michael
Published2018
Date of SubmissionJune 2018
LanguageGerman
Document typeBachelor Thesis
Keywords (DE)Humanes Serumalbumin / HSA / Pichia pastoris / Inokulum / Inkubation / OD600 / Viabilität / Trypan Blau / R+I-Schema / User Requirement Specification / URS / Standard Operating Procedure / SOP / Master Batch Record / MBR / Working Cell Bank / Schüttelinkubator / Sicherheitswerkbank
Keywords (EN)Human Serum Albumin / HSA / Pichia pastoris / Inoculum / Incubation / OD600 / Viability / Trypanblue / User Requirement Specification / URS / R+I scheme / Standard Operating Procedure / SOP / Master Batch Record / MBR / Working Cell Bank / Incubation Shaker / Biological Safety Cabinet
Restriction-Information
 _
Classification
Abstract (German)

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit einem Teil des Prozesses zur Herstellung von humanem Serumalbumin (HSA) nach den regulatorischen Erfordernissen der EU-GMP-Richtlinien, der AMBO und des AMG. Zur Darstellung des Teilprozesses wurden die notwendigen Dokumente erstellt.

Humanes Serumalbumin ist ein humanes Protein, das in der Leber gebildet wird und im Blutserum und dem Gewebe außerhalb der Gefäße vorkommt. Im Blut dient HSA zur Aufrechterhaltung des kolloidosmotischen Druckes (osmotischer Druck in das Blutgefäß hinein zur Aufrechterhaltung des Plasmavolumens), Transport hydrophober Stoffe im Blut und puffern des pH-Werts.

In der Medizin wird HSA u. a. als Blutvolumensersatz in Kochsalzlösung oder bei durch Lebererkrankungen bedingtem HSA-Mangel eingesetzt; in der Kosmetik als Bestandteil von Hautcremen; in der Analytik als Standard oder Blockiermittel bei Blots sowie als Stabilisierungsmittel für pharmazeutische und biotechnologische Produkte.

Die Hefe Pichia pastoris ist eine der in der pharmazeutischen Industrie am häufigsten genutzten Mikroorganismen. Durch die genetische Veränderung ist sie in der Lage, humane Proteine herzustellen, da sie posttranslationale Modifikationen wie die Glykosylierung beherrscht. Somit stellt sie einen idealen Produktionsorganismus für HSA dar.

Die Produktion beginnt mit der Bereitung eines Inokulums, der Vergrößerung der Biomasse mittels Batch-Verfahren und der eigentlichen Fermentation in einem zweistufigen Fed-Batch-Verfahren. Die Fermentationsbrühe wird geerntet und der Überstand von der Zellmasse mittels Zentrifugation getrennt. Für die Aufreinigung des Produktes werden Filtrations- und Chromatographiemethoden verwendet. Die Umpufferung bzw. Formulierung wird mittels Tangentialflussfiltration bewerkstelligt. Final wird das Produkt aseptisch in Vials abgefüllt und durch Gefriertrocknung konserviert.

Der in dieser Arbeit beschriebene Teil des gesamten Prozesses ist die Bereitung des Inokulums. Hier wird mit der Vorbereitung aller benötigten Materialien und Geräte begonnen. Anschließend wird eine Kultur aus der Zellbank entnommen, aufgetaut und in einem Medium für 12h bei 25°C inkubiert. Die Bereitschaft des Inokulums für die Produktion wird überprüft, in dem die Zellkonzentration mittels optischer Dichte bei 600nm (OD600) und die Viabilität mit Trypanblau-Färbung und Zellzählung bestimmt werden. Danach wird das Inokulationsgefäß über eine Sterilkupplung an das Sterilkreuz des Seedreaktors angeschlossen und überführt.

Um den Prozessschritt zu beschreiben, wurden mehrere Dokumente erstellt. Die User Requirement Specifications (URS) umfassen inhaltlich ein Lastenheft mit Charakteristika eines Pflichtenheftes, da bereits technische Details genauer spezifiziert werden. Das Rohr- und Instrumentenfließschema (R+I-Schema) zeigt das Inokulationsgefäß und die Verbindung mit dem Sterilkreuz am Seedreaktor. Der Master Batch Record (MBR), aus dem dann der Batch Production Record entsteht, umfasst die Vorbereitungsarbeiten, das Bereiten des Inokulums, die In-Prozess-Kontrollen und die Übergabe an den nächsten Prozessschritt. Einen ähnlichen Umfang beschreibt auch die Standard Operating Procedure (SOP). Hier wird für all jene Tätigkeiten, die nicht genau beschrieben sind, auf weitere SOPs verwiesen. Als Vorbereitung der Validierungsmaßnahmen wurde abschließend eine Risikoanalyse erstellt, um etwaige Gefahren identifizieren zu können.

Abstract (English)

The purpose of the project to obtain a bachelor degree was the development of a production process for human serum albumin produced by Pichia pastoris. This bachelor thesis covers the preparation of the inoculum and its transfer to the seed reactor.

The process starts with the assembling of the inoculation bottle, sterilisation of all needed equipment, materials and the medium. Then one phial of the Working Cell Bank culture is taken out of the freezer and brought to room temperature to mix it with the medium and incubate it for 12h at 25°C. To verify whether the inoculum is ready for production it has to be controlled by measuring the cell density with the optical density at 600nm (OD600) and a trypan blue cell viability test assay.

Then the inoculum is transferred to the seed reactor and connected to the inoculation port and transferred into the reactor.

For describing the process several documents have to be created:

User Requirement Specifications, R+I scheme, Standard Operating Procedure, Master Batch Record and a Risk Analysis.