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Title
Charakterisierung von Hostzellproteinen im Downstream Prozess mittels Flüssigchromatographie / Massenspektrometrie
Additional Titles
Host cell protein characterization during downstream processing by means of liquid chromatography high-resolution mass spectrometry
AuthorExl, Heidrun
CensorDürauer, Astrid
Published2017
Date of SubmissionSeptember 2017
LanguageEnglish
Document typeMaster Thesis
Keywords (DE)Hostzellproteine / Flüssigchromatographie / Massenspektrometrie / 2D-Gelelektrophorese / Downstream Processing
Keywords (EN)host cell proteins / liquid chromatography / mass spectrometry / 2D-gel electrophoresis / downstream processing
Restriction-Information
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Classification
Abstract (German)

Im Zuge der vorliegenden Masterarbeit wurde eine rasche, robuste und sensitive Methode für die Detektion und Identifizierung von Hostzellproteinen (HCPs) entwickelt und dessen Anwendung zur Verfolgung der Hostzellproteinabreicherung während des Aufreinigungsprozesses exemplarisch für ein Produkt dargestellt.

Die Ergebnisse von Experimenten, welche mit einem relativ simplen Mix aus definierten Standardproteinen sowie einer komplexen Capture Load Probe durchgeführt wurden, zeigen, nach dem enzymatischen Verdau der Proteine, für beide Proben ein beinahe identes Verhältnis von hydrophilen zu hydrophoben Peptiden. Aufgrund dieser charakteristischen Zusammensetzung der Peptide bezüglich ihrer Hydrophobizität, konnte ein HPLC Gradient für die optimale Auftrennung der Peptide berechnet werden. Dieser Gradient besteht aus drei verschiedenen Rampen. Für die erste Rampe bis zu einem Anteil von 20% Acetonitril in der mobilen Phase werden 84% des gesamten Gradienten benötigt um den hohen Anteil hydrophiler Peptide auftrennen zu können. Die restlichen 16% teilen sich in 12% bis zu einer Konzentration von 50% Acetonitril und in 4% bis zu einer Konzentration von 90% Acetonitril in der mobilen Phase auf. Weitere Experimente haben darauf hingewiesen, dass die besten Analysenergebnisse bei einer Säulentemperatur von 70°C sowie bei dem Einsatz des SMART Digest Kits von Thermo Fisher Scientific für die Probenvorbereitung zu erwarten sind. Für die Analyse von simplen bzw. sehr reinen Proben ist ein 30 Minuten Gradient und eine kurze 50 mm HPLC Säule ausreichend um beste Ergebnisse zu erzielen. Für die Analyse von komplexen Proben werden hingegen ein Gradient von mindestens 90 Minuten und eine Säulenlänge von mindestens 150 mm benötigt. Jene HPLC Parameter, sowie jene Probenvorbereitungsmethode welche zu den besten Ergebnis geführt haben, wurden für die Analyse bestimmter Downstream Proben angewandt um die Abreicherung von HCPs zu evaluieren. Zum Vergleich wurden die Proben sowohl mittels LC-MS als auch mittels 2D-GE analysiert. Im Zuge der Analysen konnte gezeigt werden, dass in einem ersten Schritt alle HCPs abgereichert wurden, welche einen sauren pI < 6 und ein Molekulargewicht zwischen 41 kDa und 60 kDa aufweisen. In einem zweiten Schritt wurden all jene HCPs mit einem pI > 7 und ein Molekulargewicht < 20 kDA und > 70 kDA abgereichert. Letztendlich konnte nach dem letzten Aufreinigungsschritt nur mehr ein HCP identifiziert werden.

Im Zuge der Masterarbeit konnte bestätigt werden, dass die Anwendung von LC-MS zur Analyse von HCPs gut geeignet ist und das Wissen um die jeweiligen Eigenschaften der abgereicherten HCPs eine Hilfestellung für mögliche Optimierungsstrategien zu deren besseren Abreicherung darstellt. Als Hochdurchsatzmethode ist sie allerding nur bedingt geeignet, wenn das Ziel der Analysen darin besteht, möglichst alle HCPs in einer Probe zu identifizieren.

Abstract (English)

In the present study a fast, robust and sensitive method for the detection and identification of host cell proteins (HCPs) was developed. Its applicability was proven by analyzing the depletion of HCPs throughout an established downstream process of one product exemplarily.

The results of experiments, which were performed with a mixture of defined standard proteins and a complex capture load sample, indicate an almost identical ratio of hydrophilic to hydrophobic peptides for both samples after enzymatic digestion of the proteins. Due to this characteristic composition of the peptides in dependence of their hydrophobicity, an HPLC gradient was calculated for the optimal separation of the peptides. This gradient consists of three different ramps. For the first ramp up to a concentration of 20% acetonitrile in the mobile phase, 84% of the total gradient is required, to be able to separate the high proportion of hydrophilic peptides. The remaining 16% are divided into 12% up to a concentration of 50% acetonitrile and in 4% up to a concentration of 90% acetonitrile in the mobile phase. Further experiments have indicated that the best analytical results can be expected at a column temperature of 70°C as well as when using the SMART Digest Kit from Thermo Fisher Scientific for sample preparation. For the analysis of simple or very pure samples, a 30 minute gradient and a short 50 mm HPLC column are sufficient to achieve the best results. However, for the analysis of complex samples, a gradient of at least 90 minutes and a column length of at least 150 mm are required. HPLC parameters as well as the sample preparation method which led to the best results have been used for the analysis of certain downstream samples to evaluate the depletion of HCPs. For comparison, the samples were analyzed by LC-MS and 2D-GE. In the course of the analyses, it was shown that in a first step all HCPs were depleted, which have an acidic pI < 6 and a molecular weight between 41 kDa and 60 kDa. In a second step all HCPs with a pI > 7 and a molecular weight < 20 kDa and > 70 kDa were depleted. Finally, only one HCP could be identified after the last purification step.

It could be confirmed that the use of LC-MS is very well suited for the analysis of HCPs. The knowledge about the individual properties of the determined HCPs provides the basis for process optimization strategies throughout downstream processing. Nevertheless, as a high-throughput approach it is only conditionally suitable if the aim of the analyses is to identify all HCPs in a sample.

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