Titelaufnahme

Titel
Vergleich von Miniaturisierten und Labormaßstab Chromatographie Systemen
Weitere Titel
Comparison of Miniaturized to Bench-Scale Chromatographic Systems
AutorInnenHofer, Josef
Begutachter / BegutachterinDürauer, Astrid
Erschienen2017
Datum der AbgabeOktober 2017
SpracheDeutsch
DokumenttypMasterarbeit
Schlagwörter (DE)Mikrosäulen / Pipettierroboter / Aufreinigungsprozess / Chromatographie / Labormaßstab
Schlagwörter (EN)high throughput / micro columns / liquid handling system / downstream / chromatography / bench-scale
Zugriffsbeschränkung
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

In der vorliegenden Arbeit wurde die Anwendung von Pipettierrobotern mit Mikrosäulen für die Entwicklung von Chromatographieschritten in Aufreinigungsprozessen untersucht. Dafür wurde getestet, ob die Säulenqualität und die Trenneffizienz von vorgepackten Mikrosäulen, die mittels automatisierbarer Pipettierroboter betrieben werden Ergebnisse liefern, die zu konventionell im Laborormaßstab eingesetzten Chromatographie Systemen vergleichbar sind.

Die Hauptvorteile des miniaturisieren Systems und der Durchführung mit dem Pipettierroboter sind die Möglichkeit der parallelen Durchführung einer großen Anzahl von Versuchen und die deutliche Reduzierung des Materialbedarfs. Zu allererst wurde die Hardware der beiden Systeme verglichen, weil der Pipettierroboter und das konventionelle Chromatographiesystem unterschiedlich in den Betriebsarten sind. Während der Pipettierroboter grundsätzlich nur diskontinuierliches Arbeiten zulässt, kann das konventionelle Chromatographiesystem über die Dauer eines Chromatogrpahielaufes kontinuierlich betrieben werden. Um die beiden Systeme vergleichbar betreiben zu können, ist eine spezielle Säulenhardware für den Pipettierroboter notwendig. Der Vergleich der miniaturisierten Säulen zu den selbstgepackten Labormaßstabssäulen erfolgte mittels eines Säulenfunktionstest zur Bestimmung des Höhenequivalentes einer theoretischen Trennstufe und des Asymmetriefaktors. Die Werte waren für das Höhenequivalentes einer theoretischen Trennstufe etwa 7 bis 10-fach höher für die Mikrosäulen, mit Ausnahme eines Harzes, bei dem die Werte etwa 4-fach niedriger waren und die Asymmetriefaktoren für Mikrosäulen waren alle höher und daher nicht vergleichbar mit den Labormaßstabssäulen. Die Ergebnisse zeigten, dass eine Anpassung der Methode für den Säulenfunktionstest der Mikrosäulen erforderlich ist, weil die Ergebnisse nicht vergleichbar mit den Tests der Labormaßstabssäulen waren. Nachdem der Pipettierroboter nicht direkt über Pumpen einen Puffergradienten, wie er häufig zur Elution von Komponenten benutzt wird, mischen kann, muss für den miniaturisieren Prozess die graduelle Mischung der Puffer durch aufeinanderfolgende isokratische Schritte unterschiedlicher Pufferzusammensetzung simuliert werden. Experimente ohne und mit Proteinen (ein zwei Komponenten System bestehend aus α-Chymotrypsinogen und Lysozym) wurden durchgeführt, um die Vergleichbarkeit des resultierenden Elutionsprofils mit einem derart simulierten Gradienten und dem Gradienten des Laborsystems zu überprüfen. Aus diesen Versuchen konnte dann abgeleitet werden, wie viel isokratische Schritte unterschiedlicher Pufferzusammensetzung für die Simulation eines linearen Gradienten notwendig sind, um einen vergleichbaren Elutionspeak zu erhalten. Die Ergebnisse zeigten, dass 3,4 Stufen pro Säulenvolumen den linearen Gradienten ausreichend detailliert nachstellen konnten. Bei verschiedenen Verweilzeiten wurde nicht nur der Einfluss der Systeme, sondern auch der Einfluss der verschiedenen Eigenschaften von Proteinen getestet. Die Ergebnisse zeigten, dass bei 7 Minuten Verweilzeit beide Systeme eine gute Korrelation mit dem zwei Komponenten System von Proteinen aufweisen. Ein anschließender Test der Systeme mit einem hausinternen Produkt in einer komplexen Matrix zeigte, dass die Anwesenheit von Verunreinigungen von großer Bedeutung für die Trenneffizienz war und die Methode nicht ohne weitere Optimierung von einem reinen Zwei-Komponenten Gemisch mit Modellproteinen auf eine reale Probe übertragbar war.

Diese Arbeit identifizierte die wichtigsten Einflussparameter für die Vergleichbarkeit der beiden Systeme. Diese stellen die Anzahl der isokratischen Elutionsschritte und die Verweilzeit dar. Trotzdem wird eine weitere Untersuchung in größeren Säulendimensionen empfohlen, um mehr Informationen zu generieren und die Qualität der Vorhersagen mit dem Pipettierroboter für größere Chromatographieläufe zu verbessern.

Zusammenfassung (Englisch)

In the present study the applicability of liquid handling systems with micro columns for the development of chromatography steps in downstream processes was examined. For that purpose the column performance and separation efficiency of pre-packed micro columns operated by an automated liquid handling system was compared to self-packed bench scale columns operated by a commercially available chromatographic workstation.

The major advantage of the small scale system using the micro columns is the opportunity of parallelization and the significant reduction of material consumption. First the hardware was compared. Liquid handling systems and conventional bench scale chromatography systems are basically different in the mode of operation. While the liquid handling system can only be operated discontinuously the bench scale system works continuously. Therefore, special column hardware was required for the small scale liquid handling systems.

The column performance was compared by a column function test determining the height equivalent of one theoretical plate and asymmetry factor. The values were for the height equivalent of one theoretical plate from about 7- to 10-fold higher except for one resin, where the values were about 4-fold lower and the asymmetry factors were all higher for micro columns and therefore not comparable. Results also showed that further investigation in the methods for the columns function test regarding pulse length is needed and the method of the manufacturer is not comparable to the test of the bench scale columns.

Due to technical limitations the liquid handling systems could not directly mix a linear gradient as commonly used in the elution step during chromatography. Such a linear gradient had to be mimicked by consecutive isocratic steps. Experiments without and with proteins (a two compound system containing α-chymotrypsinogen and lysozyme) were carried out to determine whether the resulting elution profiles were comparable to those obtained with the bench scale system. Thereof, the number of isocratic steps needed for the small scale experiments to mimic a comparable elution profile was derived. Results showed that 3.4 steps/CV mimic the linear gradient in sufficient details.

At various residence times not only the influence of the systems but also the influence of the different characteristics of proteins was investigated. Results showed that at 7 minutes residence time the small scale separation by micro columns showed good agreement to the bench scale system regarding the separation of the two-compound protein mixture. Testing the established parameters for an in-house molecule present in a complex matrix showed that the influence of impurities was of high importance and the set up method for the model system could not simply be transferred to this complex sample.

This work identified the major parameters of influence for the comparability of the two systems which are the number of isocratic elution steps and the residence time. Nevertheless further investigation in larger column scales is recommended to generate more information and improve the quality of prediction with the liquid handling system for larger scale chromatography runs.