Titelaufnahme

Titel
Größenausschluss HPLC Methode zur Bestimmung von Antikörperaggregaten während der Produktion
Weitere Titel
Size exclusion HPLC method for determination of antibody aggregates during production
AutorInnenAlt, Roland
Begutachter / BegutachterinMaurer, Michael
Erschienen2017
Datum der AbgabeOktober 2017
SpracheEnglisch
DokumenttypMasterarbeit
Schlagwörter (DE)Antikörper / Größenausschluß / HPLC / CHO / Aggregate
Schlagwörter (EN)Antibody / Size exclusion / HPLC / CHO / Aggregates
Zugriffsbeschränkung
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Weltweit werden monoklonale Antikörper (mAbs) als therapeutische Mittel zur Behandlung bestimmter Krankheiten eingesetzt. Die meisten von ihnen werden rekombinant in tierischen Zellkulturen wie Chinese Hamster Ovary (CHO) Zellen produziert, wobei eine variable Produktqualität erzeugt wird, welche erst am Ende der Produktion überprüft wird. Die Food and Drug Administration (FDA) startete 2002 die Process Analytical Technology (PAT) Initiative für die Pharmaindustrie, um eine optimale Produktion und eine gleichbleibende Produktqualität zu gewährleisten. Ziel ist es, die Einhaltung bestimmter Produktqualitätskriterien, so genannten Critical Quality Attributes (CQAs) während der Produktion sicherzustellen.

Eines dieser Qualitätsattribute ist die Proteinaggregation. Derzeit ist die Standardmethode zur Bestimmung der Proteinaggregation die Größenausschlusschromatographie (SEC) in Verbindung mit einer Protein-A-Affinitätschromatographie als Vorreinigungsschritt. Zusätzlich dazu, dass eine Affinitätschromatographie kosten- und zeitaufwändig ist, werden durch die Verwendung einer Protein-A-Affinitätschromatographie als Vorreinigungsschritt, verglichen mit der alleinigen Anwendung einer Größenausschlusschromatographie, die Wahrscheinlichkeit erhöht Proteinaggregation durch die Analytik selbst zu induzieren. Verzerrte Ergebnisse, wie diese, können nicht für die weitere Modellbildung, wie von der FDA gefordert, verwendet werden.

Deshalb ist es notwendig, eine SEC-Methode zu etablieren, welche eine direkte Bestimmung der Proteinaggregation aus dem Kulturüberstand ermöglicht. Neben der qualitativen Bestimmung wurde sowohl für das Antikörpermonomer als auch für das Dimer ein Quantifizierungskonzept ausgearbeitet. Der zweite Schritt war diese Methode anzuwenden. Zu diesem Zweck wurde ein zweidimensionaler, dreistufiger Versuchsaufbau einer CHO-fed-batch-Kultur durchgeführt, um die Korrelation zwischen den kritischen Prozessparametern Kultivierungstemperatur und Glukosekonzentration im Feedmedium und den kritischen Qualitätsattributen Proteinaggregation und anderen nicht identifizierten Substanzen zu untersuchen, welche während der Produktion erzeugt wurden.

Zusammenfassung (Englisch)

Worldwide, monoclonal antibodies (mAbs) are in use as therapeutic agents for the treatment of certain diseases. The majority of them are recombinantly produced in mammalian cell culture like Chinese Hamster Ovary (CHO) cells, where a variable output is generated and the product quality is checked afterwards. The Food and Drug Administration (FDA) started the Process Analytical Technology (PAT) initiative in 2002 for the pharmaceutical industry, to ensure optimal production and consistent product quality. The goal is to control compliance with certain product quality criteria, so-called Critical Quality Attributes (CQAs) during production.

One of these Quality Attributes is protein aggregation. Currently the standard method for determining protein aggregation is size exclusion chromatography (SEC) in conjunction with a protein A affinity chromatography as a pre-purification step. Beside affinity chromatography is additionally cost- and time-consuming, by the use of protein A affinity chromatography as a pre-purification step, the certainty to not induce protein aggregation at analytics is reduced, compared to apply size exclusion chromatography only. Distorted results, like these, cannot be used for further modelling, as demanded by the FDA.

Therefore, it is necessary to establish an SEC method which allows direct determination of protein aggregation from the mammalian cell culture supernatant. Besides the qualification attempt, a quantification concept was worked out for both, the antibody monomer and the dimer. However, the second step was to apply this method. For this purpose a 2 dimensional 3 level full factorial design of a CHO fed batch culture was carried out, to exam the correlation between the critical process parameters cultivation-temperature and glucose-concentration in feed media and the critical quality attributes protein aggregation and other unidentified substances produced during fermentation.

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