Bibliographic Metadata

Title
Verbesserung der Homologen Rekombination in der Hefe Pichia Pastoris
Additional Titles
Improving Homologous Recombination in the Yeast Pichia Pastoris
AuthorErgoth, Stefan
CensorMetzner, Christoph
Published2017
Date of SubmissionOctober 2017
LanguageEnglish
Document typeMaster Thesis
Keywords (DE)Pichia Pastoris / Homologe Rekombination / Non Homologous End Joining / Gene Targeting Effizienz / Mating
Keywords (EN)Pichia Pastoris / Homologous Recombination / Non Homologous End Joining / Gene targeting efficiency / Mating
Restriction-Information
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Classification
Abstract (German)

In dieser Arbeit wurde bestätigt, dass die Homologe Rekombination durch knockout der Gene KU70/KU80 in der Hefe Pichia pastoris verbessert werden kann. Das Heterodimer Ku70/Ku80 ist notwendig für den Non-Homologous End Joining Pathway im DNA double strand break repair - Mechanismus. Es wurde außerdem gezeigt, dass diese Knockouts einen starken negativen Einfluss auf die Mating-Effizienz haben.

Homologe Rekombination (HR) und Non homologous end joining (NHEJ) sind zwei Hauptmechanismen für die Reparatur von DNA Doppelstrangbrüchen. Durch Verbesserung der HR kann die Gene targeting-Effizienz erhöht werden. Das Ziel dieser Arbeit war die Verbesserung der Homologen Rekombination durch knockouts von KU70, KU80 und DNL4 aus dem NHEJ-pathway und die Überexpression von RAD51, RAD52, RAD54 aus dem HR-pathway. Weiters wurde die Mating-Effizienz getestet, um eine Eignung als Plattform für Antibody Surface Display festzustellen. HR-Effizienz wurde getestet indem die Mutanten mit Fragmenten mit unterschiedlich langen homologen Armen transformiert wurden. Die ku70Δ/ku80Δ-Stämme wiesen eine Verbesserung der korrekten Integrationseffizienz für das 250bp-Fragment von 69,7% bis 71,3% auf im Vergleich zum Wildtyp. Die Mating-Effizienz wurde um 60% bis 100% reduziert. Die Überexpression von RAD51 zeigte keine Verbesserung der HR, die anderen Überexpressionsstämme konnten nicht produziert werden.

Abstract (English)

In this thesis, it was confirmed that homologous recombination in the yeast Pichia pastoris (Komagataella phaffii) could be improved by knocking out genes encoding the Ku70/Ku80-heterodimer, which is required for the non-homologous end joining pathway in DNA double strand break repair. It was also shown, that these knockouts have a strong negative influence on the mating ability of those cells. Homologous recombination (HR) and non-homologous end joining (NHEJ) are the two main pathways in DNA double strand break repair (DSBR). By improving homologous recombination, gene targeting efficiency can be increased. The aim of this thesis was to improve homologous recombination by either knocking out the NHEJ-players KU70, KU80 and DNL4 or by overexpressing the HR-players RAD51, RAD52 and RAD54. Further mating efficiency was tested to determine if this strain is suitable as a platform for antibody surface display. Homologous recombination efficiency was tested by transformation with fragments with homologous arms of different lengths. For the ku70Δ/ku80Δ-strains correct integration efficiency of the fragment with 250 bp-homologous arms was increased by 69.7 % to 71.3 % compared to the wild type. Mating efficiency which was determined by plating assays, was reduced by 60 % to 100 % compared to the wild type. RAD54 overexpression showed no improvement of HR, the other strains could not be implemented.