Bibliographic Metadata

Title
Transkriptions-unabhängige Rolle von MITF im Zytoplasma von Melanomzellen
Additional Titles
Transcription-independent Role of MITF in the Cytoplasm of Melanoma Cells
AuthorAllram, Melanie
Published2018
Date of SubmissionJune 2018
LanguageEnglish
Document typeBachelor Thesis
Keywords (DE)Melanomen / MITF
Keywords (EN)Melanoma / MITF
Restriction-Information
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Classification
Abstract (German)

Mikrophthalmie-assoziierter Transkriptionsfaktor (MITF) gilt als wichtiger Regulator in der Entwicklung von Melanozyten und deren Pigmentierung. Neben der typischen Lokalisation im Kern, ist MITF auch im Zytoplasma von Melanomazellen präsent, was die Frage aufwirft, ob es dort eine transkriptions-unabhängige Funktion ausübt. Um dies zu beantworten wurde eine Mutante des Proteins hergestellt, bei der die Arginine 214-217 mit Alaninen (b4RA) ersetzt wurden. Das mutierte MITF Protein kann dadurch nicht in den Kern transportiert werden und weist ein fehlerhaftes Transaktivierungspotential auf. Funktionelle Tests zeigten, dass b4RA-MITF keinen Effekt auf die Migration und Proliferation von Lu1205 und A375P Melanomzellen hat. Die Behandlung von Wildtyp und b4RA-überexprimierenden Lu1205 Zellen mit Camptothecin zeigte eine signifikant verringerte Akkumulation von p53 und AIF, zwei Marker für intrinisiche Apoptose, auf. Diese Daten deuten auf eine Rolle des zyto-plasmatischen MITF Proteins in der Apoptose hin. Um spezifisch den intrinischen Apoptoseweg zu induzieren, wurden die Zellen mit Hydrogenperoxid (H2O2) und 4-nitroquinoline-1-oxide (4-NQO) behandelt, um oxidativen Stress auszulösen. Über-expression von Wildtyp- und b4RA-MITF führte zu erhöhten Basallevels von p53 und AIF, die nach H2O2 und 4-NQO Behandlung nicht weiter anstiegen. Co-Immunpräzipitation zeigte, dass MITF mit receptor of activated protein kinase C 1 (RACK1) im Zytoplasma interagiert und dass diese Interaktion durch Aktivierung der Protein Kinase C (PKC) verstärkt wird. Da RACK1 eine Rolle in Apoptose spielt, stellt die Untersuchung des Zusammenspiels von MITF, RACK1 und PKC in diesem Prozess einen vielversprechenden Forschungsgegenstand dar.

Abstract (English)

Microphthalmia-associated transcription factor (MITF) is regarded as a key player in melanocyte development and pigmentation. Besides its typical localization in the nu-cleus, it is also present in the cytoplasm of melanoma cells, which raises the question whether it has a transcription-independent role. To address this question, arginines 214-217 of MITF were mutated to alanines (b4RA) which results in the failure of nu-clear transport and loss of transactivation potential of the mutant protein. Functional assays showed that cytoplasmic MITF does not affect migration or proliferation of Lu1205 and A375P melanoma cells. Interestingly, Camptothecin treatment resulted in a significantly decreased accumulation of the intrinsic apoptosis markers p53 and apoptosis-inducing factor (AIF) in Lu1205 cells overexpressing wild type or b4RA mutant MITF, which points towards a role of cytoplasmic MITF in apoptosis. To spe-cifically target the intrinsic apoptosis pathway, cells were treated with the oxidative stress-inducing agents hydrogen peroxide (H2O2) and 4-nitroquinoline-1-oxide (4-NQO). Overexpression of wild type and b4RA-MITF resulted in increased basal lev-els of p53 and AIF, which did not further increase upon H2O2 and 4-NQO treat-ments. Co-immunoprecipitation studies revealed that MITF interacts with receptor of activated protein kinase C 1 (RACK1) in the cytoplasm and this interaction was fur-ther enhanced by activation of protein kinase C (PKC). Given the role of RACK1 in apoptosis, it will be interesting to study the interplay of MITF, RACK1 and PKC in this process.