Bibliographic Metadata

Title
Analyse von Proteinen in einer nicht über Parvalbumin vermittelten Fischallergie
Additional Titles
Analysis of Proteins in non-Parvalbumin-mediated Fish Allergy
AuthorGano, Patrick
Thesis advisorRaith, Marianne
Published2018
Date of SubmissionJune 2018
LanguageEnglish
Document typeBachelor Thesis
Keywords (DE)Fischallergie / rekombinant / Aldolase / Enolase / Klonierung / Kollagen / Regenbogenforelle / Atlantischer Lachs
Keywords (EN)fish allergy / recombinant / aldolase / enolase / cloning / collagen / rainbow trout / Atlantic salmon
Restriction-Information
 _
Classification
Abstract (German)

Fisch zählt zu den acht häufigsten Quellen von Nahrungsmittelallergenen. Dagegen sensibilisierte Personen klagen über Niesen, Verdauungsprobleme oder Hautausschläge. Verantwortlich dafür ist meist Parvalbumin, ein Calcium-bindendes Protein, welches zudem stabil gegenüber Erhitzen und proteolytischem Verdau ist. Darüber hinaus wurden kürzlich weitere IgE-reaktive Fischproteine beschrieben: Aldolase, Enolase und Kollagen. Aldolase und Enolase wurden als Allergene im Kabeljau, Lachs und Thunfisch und Kollagen wurde in mehreren Fischspezies beschrieben. Des Weiteren konnte im Labor Aldolase und Enolase der Regenbogenforelle (Oncorhynchus mykiss), einem nahen Verwandten des Lachs, bereits unter denaturierenden Bedingungen gewonnen werden. Zudem zeigten in früheren Versuchen im Labor einige Patienten auf Immunblots IgE Reaktivität mit hochmolekularen Proteinen, welche sich nach einer Analyse mittels Massenspektrometrie als Kollagene herausstellten.

Das Ziel dieser Arbeit war es, rekombinante Aldolase und Enolase der Forelle unter nativen Bedingungen in Escherichia coli zu produzieren, um später deren IgE-Reaktivität zu bestimmen sowie natürliches Kollagen vom atlantischen Lachs (Salmo salar) aufzureinigen und IgE-reaktive Kollagenisoformen für eine rekombinante Produktion zu klonieren. Um Aldolase und Enolase unter nativen Bedingungen herzustellen, wurden die optimale Expressionstemperatur und -dauer in Escherichia coli bestimmt. Um natürliches Kollagen aufzureinigen sollte eine geeignete Quelle bestimmt sowie eine passende Extraktionsmethode etabliert werden. Zur Bestimmung IgE-reaktiver Kollagenisoformen wurde Kollagen aus gekochter Lachshaut gereinigt und in IgE Immunblots mit Seren von Patienten, die gegen hochmolekulare Fischproteine sensibilisiert waren, analysiert. Eine massenspektrometrische Analyse IgE-reaktiver Banden ermöglichte die Bestimmung allergieauslösender Kollagenisoformen. Die Aufreinigung von rekombinanter Aldolase und Enolase war erfolgreich. Des Weiteren zeigen erste Hinweise zur IgE-Reaktivität, dass im Lachs die α1-Kette und α2-Kette von Kollagen Typ I allergieauslösend sind. Zudem wurde eine Klonierungsstrategie für die cDNA der α1 Kette von Kollagen Typ I konzipiert. Die rekombinante Produktion von Fischallergenen wird zu einem besseren Verständnis von Fischallergien beitragen und schließlich den Weg für eine bessere Diagnose ebnen.

Abstract (English)

Fish is among the eight most common food allergen sources. Patients allergic to fish complain about sneezing, digestive problems or skin rashes. Parvalbumin, a calcium-binding protein highly stable to heat and proteolytic digestion, has been identified as the major allergen in fish. However, also other fish proteins were recently described to cause IgE reactivity: aldolase, enolase and collagen. Aldolase and enolase have been described as allergens in cod, salmon and tuna, and collagen has been identified as an allergen in several fish species. In our lab, aldolase and enolase from rainbow trout (Oncorhynchus mykiss), a local fish closely related to salmon, have already been produced in Escherichia coli under denaturing conditions. Furthermore, former colleagues in the lab observed that some patients displayed IgE reactivity to high-molecular weight proteins in immunoblots. These proteins were identified by mass spectrometry analysis as collagens.

The aim of this thesis was to express trout aldolase and enolase under native conditions for later IgE-reactivity experiments as well as to purify natural collagen from Atlantic salmon (Salmo salar) and to clone IgE-reactive collagen isoforms for further recombinant production. To obtain recombinant trout aldolase and enolase under native conditions, optimal temperature and time had to be determined for expression of the proteins in Escherichia coli. For purification of natural collagen, the ideal tissue for protein extraction had to be identified and an extraction method had to be established. To determine IgE-reactive collagen isoforms, natural collagen purified from cooked skin of salmon was analyzed in IgE immunoblots with patients’ sera with known sensitization to high-molecular-weight fish proteins. Mass spectrometry analysis of the IgE-reactive protein bands allowed identification of allergenic collagen isoforms. Recombinant trout aldolase and enolase were successfully produced in E. coli under native conditions and natural salmon collagen could be purified from cooked skin. Additionally, first evidence of IgE reactivity to collagen has shown that the alpha-1(I) and alpha-2(I) chains from Atlantic salmon are allergenic. Furthermore, a cloning strategy for a cDNA coding for the collagen alpha-1(I) chain was developed. In general, recombinant production of fish allergens other than parvalbumin might contribute to a better understanding of fish allergy and should finally pave the way for better diagnosis of fish allergic individuals.