Bibliographic Metadata

Title
Struktur-Funktions-Analyse von Leukämie-Fusionsproteinen mit intrinsisch ungeordneten Domänen
Additional Titles
Structure-Function Analysis of Low-Complexity Domain-Containing Leukemia Fusion Oncoproteins
AuthorKuchynka, Natalie
Published2018
Date of SubmissionJune 2018
LanguageEnglish
Document typeBachelor Thesis
Keywords (DE)Leukämie / Fusionsprotein / NUP98 / Phasenseparierung / Biotin-Isoxazol
Keywords (EN)Leukemia / Fusion Protein / NUP98 / Phase Separation / Biotinylated Isoxazole
Restriction-Information
 _
Classification
Abstract (German)

Mehr als 1000 Menschen in Österreich werden jährlich mit Leukämie diagnostiziert. Akute myeloische Leukämie (AML) wird häufig durch genetische Veränderungen wie etwa Translokationen verursacht, welche zur Expression eines neuartigen Fusionsproteins führen können. 1-2% aller AML-Patienten weisen eine Translokation innerhalb des NUP98 Gens auf. Die resultierenden NUP98-Fusionsproteine beinhalten intrinsisch ungeordnete Domänen, bestehend aus Phenylalanin-Glycin-Dipeptiden (FG-repeats), welche zu einer intrazellulären Phasenseparierung beitragen können. Der Leukämie-induzierende Mechanismus der NUP98-Fusionsproteine ist bis heute ungeklärt und es ist nicht bekannt, ob Phasenseparierung in diesen Prozess involviert ist. Aus diesem Grund war das Ziel dieser Arbeit herauszufinden, wie FG-repeats von verschiedenen NUP-Fusionsproteinen die Phasenseparierung beeinflussen. Dafür wurden fünf verschiedene NUP-Konstrukte mit verschiedener Anzahl an FG-repeats mittels Gateway® Technologie kloniert und anschließend in murinen embryonalen Fibroblasten überexprimiert. Um die biophysikalischen Eigenschaften dieser fünf exogenen Proteine genauer zu untersuchen, wurden die Lysate mit Biotin-Isoxazol (B-Isox) behandelt. Dieses Reagens kann selektiv Protein-Aggregate präzipitieren. Das Präzipitations-Potential der NUP-Fusions-Konstrukte in diesem Ansatz wurde mittels Western Blot untersucht. Diese Untersuchungen zeigten, dass die Anzahl der FG-repeats eines Proteins mit der Fähigkeit zur Präzipitation durch B-Isox korreliert. Weiters scheint jener Teil ohne FG-repeats die Effektivität der Phasenseparierung ebenfalls zu beeinflussen. Diese Ergebnisse liefern neue Erkenntnisse, welche zur Aufklärung der onkogenen Mechanismen der NUP98-Fusionsproteine beitragen könnten.

Abstract (English)

More than 1000 people in Austria are diagnosed with leukemia every year. A particularly aggressive form of this disease is acute myeloid leukemia (AML), which is often caused by genetic alterations. Among those, translocations can lead to the expression of novel fusion proteins. About 1-2% of all AML patients have a translocation involving the NUP98 gene. The resulting NUP98-fusion proteins contain low-complexity domains composed of phenylalanine-glycine repeats (FG-repeats). These domains have been implicated in intracellular phase separation, caused by aggregation of macromolecules. The leukemogenic mechanism of NUP98-fusion proteins is poorly understood, and it is not known if and how phase separation is involved in this process. Therefore, the aim of this study was to examine how FG-repeats of different NUP-fusion proteins affect the formation of intracellular aggregates. Five different NUP-fusion constructs with varying numbers of FG-repeats were assembled using Gateway® Cloning and exogenously expressed in murine embryonic fibroblasts. To investigate the biophysical properties of these proteins, lysates were treated with biotinylated isoxazole (b-isox), which can be used to selectively precipitate protein aggregates. Western blot analysis was used to investigate the aggregation potential of the NUP-fusion constructs in this assay. We found that the number of FG-repeats correlated with intracellular aggregation. In addition, the non-FG-containing part of the fusion proteins also influenced the effectiveness of precipitation. These findings provide new insights that could help to clarify the oncogenic mechanisms of NUP98-fusion proteins.