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Title
NFκB Aktivierung als Marker für Entzündungen in Zellkulturlinien
Additional Titles
NFκB Activation as Marker for Inflammation in Cell Culture Cells
AuthorPlott, Stefan
Thesis advisorRiegel, Elisabeth
Published2018
Date of SubmissionJune 2018
LanguageEnglish
Document typeBachelor Thesis
Keywords (DE)NF-κB / IκB / siRNA / Zellbasierte Testsysteme / Entzündung / Zellkultur / siRNA
Keywords (EN)NF-κB / IκB / cell based test system / inflammation / cell culture / siRNA
Restriction-Information
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Classification
Abstract (German)

Entzündungsreaktionen stellen ein Problem bei der Entwicklung von neuen Medizinprodukten wie Implantaten dar. Das Ziel der Arbeit war es, ein Zellkulturassay zur Detektion von entzündungsfördernden Substanzen in Extrakten von Medizinprodukten zu verbessern. Ein solches zellbasiertes Testsystem würde gegenüber den aktuell verwendeten Tierversuchen vielfältige Vorteile bieten. Dafür wurden verschiedene Zelllinien mit einem enthaltenen Konstrukt getestet, welches es erlaubt die Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-κB, über ein dual-Luciferase Assay zu bestimmen. Die Aktivierung des Signalweges erfolgte dabei durch Zugabe von verschiedenen Substanzen mit bekannter induzierender Wirkung. Der Vergleich der Messwerte mit einer existierenden HEK293 Zelllinie zeigte, dass die neu hergestellte Fibroblasten- (WI-38 SV40) Zelllinie eine geringfügig höhere Sensitivität für TNFα und PMA aufwies. Die ebenfalls neue Monozyten- (U937) Zelllinie wies eine deutlich geringere Sensitivität auf. Weiters wurde versucht die Sensitivität der HEK293 Zelllinie durch die Repression eines Inhibitors (NF-κBIA) des NF-κB Signalweges, mittels RNA Interferenz zu erhöhen. Um die Expression von IκBα mittels Western Blot testen zu können, wurde ein Plasmidvektor hergestellt, der für ein FLAG getagtes IκB protein kodiert. Es wurde festgestellt, dass die untersuchten siRNAs die Expression von IκBα deutlich reprimieren, was jedoch zu keiner Erhöhung der Sensitivität des Tests führte.

Abstract (English)

Inflammatory reactions are a problem for the development of new medical products like implants. The aim of this project was to improve a cell-based assay which can detect inflammation causing substances in extracts of medical products. This assay would have many benefits compared to currently used animal experiments. Different cell lines containing a construct which allows to measure the activation of the NF-κB pathway by using a dual luciferase assay were tested. The pathway was activated in experiments using different known inducing chemicals. Comparison with the existing HEK293 cell line showed, that the new fibroblast WI-38 SV40 cell line was slightly more sensitive for TNFα and PMA. The new monocyte (U937) cell line was clearly less sensitive than the other cell lines. As a second approach, improving the sensitivity by repressing IκBα, an inhibitor of the NF-κB pathway, was tried using small interfering RNA. To test protein expression levels via western blot, a plasmid coding for FLAG tagged NFKBIA was produced and transfected together with siRNA. While the tested siRNAs clearly lowered IκBα expression levels, there was no increase in the sensitivity of the test.

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