Bibliographic Metadata

Title
Aufreinigung von pDNA - Aktueller Stand und Perspektiven
Additional Titles
Purification of pDNA – Current Status and Prospects
AuthorWurth, Jakob
Published2018
Date of SubmissionSeptember 2018
LanguageEnglish
Document typeBachelor Thesis
Keywords (DE)Plasmid / Aufreinigung / pDNA / Downstream / große Plasmide / DNA Impfstoff / supercoiled / ccc / Gentherapie
Keywords (EN)plasmid / purification / pDNA / downstream / large plasmids / DNA vaccine / supercoiled / ccc / genetherapy
Restriction-Information
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Classification
Abstract (German)

In den letzten Jahrzehnten ist der therapeutische Bedarf an hochreiner Plasmid-DNA (pDNA) drastisch gestiegen. pDNA findet eine breite Anwendung in der Gentherapie als DNA-Impfstoff und es wurde gezeigt, dass die Anwendung im Vergleich zu anderen verfügbaren Impfstoffen wesentlich sicherer ist und die Produktionszeiten auf wenige Wochen reduziert werden können. Bei der Herstellung von pDNA ist ein mehrstufiger Aufreinigungsprozess notwendig, um die hohen Qualitätsstandards und behördlichen Anforderungen zu erfüllen. Die US-FDA hat für die Reinheit der Plasmid-DNA einen supercoiled-Gehalt von > 80 % festgelegt, da die supercoiled ccc-Form die therapeutisch aktive Form ist. Vorschriften für pharmazeutische Produkte erfordern in der Regel mehr als 90% des Plasmids in sc-Form. Die Aufreinigung der pDNA in ihre hochreine Form erfolgt im Downstream-Prozess in mehreren Schritten. „Primary Recovery“ ist der erste Rückgewinnungsschritt, gefolgt von einer Aufreinigung in mehreren Schritten, für gewöhnlich als „Capture“, „Intermediate“ und „Polishing“ bezeichnet“. Ziel dieser Schritte ist eine Aufkonzentrierung und eine sukzessive Aufreinigung wobei das gewünschte Produkt zu einer Produktreinheit von über 90% gebracht wird. Es stehen verschiedene Reinigungsmethoden wie Filtration, Chromatographie und Fällung zur Verfügung, die jedoch Vor- und Nachteile haben.

Ziel dieser Arbeit ist die Bewertung der Vor- und Nachteile der diversen Methoden im Hinblick auf die charakteristischste Eigenschaft der pDNA, ihre Größe. Die Methoden werden hinsichtlich ihrer Effizienz und Anwendbarkeit in einer kommerziellen Produktion verglichen und der aktuelle Stand der pDNA Aufreinigung erfasst, sowie versucht zukünftige Entwicklungen im Downstream-Prozess vorherzusagen. Neue Ansätze zur Aufreinigung von pDNA werden ebenfalls demonstriert und ihre Anwendbarkeit für größere Plasmide, die größer als 10 kbp sind, diskutiert. Ein möglicher Zugang ist, bei der Aufeinigung von großen Plasmiden, einen Wechsel von diffusionsgetriebenen chromatographischen Medien zu Konvektivströmungsmedien durchzuführen, da diese auf Grund von höheren Durchsätzen und kürzeren Prozesszeiten vorteilhaft sind.

Abstract (English)

In the last decades, the therapeutic demand for highly purified plasmid DNA (pDNA) has risen drastically. PDNA has a broad application in gene therapy as a DNA vaccine. It has been shown that pDNA is much safer compared to other available vaccines and additional production times can be reduced to a few weeks. The production of pDNA requires a multi-stage purification process to meet the high quality standards and authority requirements. The US-FDA has stipulated a supercoiled content of > 80 % for the purity of plasmid DNA, since the supercoiled (sc), covalently closed circular (ccc) form is the therapeutically active form. Regulations for pharmaceutical products usually require more than 90% of the plasmid in sc-form. This can be achieved during the downstream process, where pDNA is processed into its highly pure sc-form in several steps. Primary recovery followed by a capture step of the product, then followed by an intermediate recovery and then last the final purification, where a polishing steps results in a product purity of over 90%. A variety of different purification methods are available, such as filtration, chromatography, and precipitation, and they all have certain advantages and disadvantages.

The trend of steadily growing plasmid sizes, which has been observed over the past decades, requires new purification methods. In this work we evaluate the advantages and disadvantages of different methods with regard to the most characteristic properties of pDNA, its size and shape.

We compare the methods with regard to efficiency and their applicability in commercial production, documenting the current status as well as attempting to predict future developments in downstream processing. New approaches for the purification of pDNA are also demonstrated and their applicability for larger plasmids, greater than 10 kbp, is discussed. One approach is the change from diffusion-controlled chromatographic media to convective-flow media in purification of large plasmids due to higher throughputs and shorter processing times.