Titelaufnahme

Titel
Verifikation der Struktur und Funktion des Eisen(II)-Transporters FeoB von Pseudomonas aeruginosa / Vorgelegt von: Andrea Lenger
Weitere Titel
Verification of structure and function of the ferrous iron-transporter FeoB from Pseudomonas aeruginosa
AutorInnenLenger, Andrea
GutachterKowalski, Heinrich
Erschienen2017
HochschulschriftWien, FH Campus Wien, Masterarb., 2017
Anmerkung
Abweichender Titel laut Übersetzung der Verfasserin/des Verfassers
Datum der AbgabeMai 2017
SpracheDeutsch
DokumenttypMasterarbeit
Schlagwörter (DE)FeoB / Eisen-Transport / Eisen-Stoffwechsel / Mukoviszidose / Antimikrobielle Resistenz
Schlagwörter (EN)FeoB / Iron-transporter / Iron-metabolism / Cystic Fibrosis / Antimicrobial resistance
URNurn:nbn:at:at-fhcw:1-4609 Persistent Identifier (URN)
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Verifikation der Struktur und Funktion des Eisen(II)-Transporters FeoB von Pseudomonas aeruginosa [3.71 mb]
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Pseudomonas aeruginosa ist ein weit verbreitetes Bakterium, welches durch seine Anpassungsfähigkeit in verschiedensten Habitaten überleben kann. Es handelt sich hierbei um einen pathogenen Organismus, der verschiedene Krankheitsbilder auslösen kann. P. aeruginosa wird jedoch zu der Klasse der Opportunisten gezählt, da das Bakterium selten Krankheiten in gesunden Individuen auslöst. Durch die starke Präsenz als Umweltkeim ist der Erreger dennoch Hauptursache einiger Infektionen in immun-supprimierten Personen. Am häufigsten treten Lungenentzündungen bei Patienten mit zystischer Fibrose, Infektionen von Brandwunden, sowie nosokomiale Infektionen auf.

Durch die hohe natürliche Resistenz des Bakteriums gegen verschiedene Antibiotika, sind Pseudomonas Infektionen äußerst schwierig zu behandeln. Die intrinsische Resistenz ist vor allem bedingt durch eine äußerst niedrige Membran-permeabilität sowie durch effiziente drug-efflux-pumps welche antimikrobielle Substanzen aus dem inneren der Zelle entfernen.

Obwohl P. aeruginosa wie viele Opportunisten eine geringe Pathogenität aufweist, zeigt es eine hohe Virulenz. Diese ermöglicht dem Bakterium eine rasante Besiedelung des Wirtes sowie eine schnelle Vermehrung in ihm. Verschiedene Faktoren, vor allem jedoch die Fähigkeit Biofilme zu produzieren, ermöglichen diese hohe Virulenz. Diese erschweren die Behandlung, da sie als physische Barriere für antimikrobielle Substanzen und Zellen des Immunsystems fungieren.

Für viele Virulenzfaktoren und verschiedene grundlegen Stoffwechsel-Prozesse ist Eisen essenziell. Diese Abhängigkeit macht den Eisen-Stoffwechsel zu einem attraktiven Ziel im Kampf gegen P. aeruginosa. Vor allem der Prozess der Eisenaufnahme eignet sich als Angriffspunkt, da alle nachfolgenden Prozesse über ihn reguliert werden.

Da Eisen in zwei unterschiedlichen Valenz-Stadien vorliegen kann, haben Bakterien unterschiedliche Verfahren zur Aufnahme entwickelt. Die Aufnahme des beinahe unlöslichen dreiwertigen Eisen Fe(III) erfolgt durch Siderophore, welche eine hohe Affinität für Eisen aufweisen. Die Aufnahme von zweiwertigem Eisen Fe(II) ist bis dato weniger verstanden. Bekannt ist die Aufnahme durch die Systeme Feo und Sit. In P. aeruginosa ist nur das Feo System vorhanden, was die Attraktivität als Angriffspunkt unterstreicht.

Das Feo System wird aus drei unterschiedlichen Proteinen aufgebaut, FeoA, FeoB und FeoC. Die Rolle der einzelnen Proteine ist bisher kaum verstanden, allerdings weiß man, dass FeoB Fe(II) über die innere Membran transportiert. Durch die natürlichen Eigenschaften von Membranproteinen, die es erschweren sie in vitro zu untersuchen, gibt es nur wenige Untersuchungen zu FeoB. Man weiß jedoch, dass es aus drei Domänen aufgebaut ist.

Die N-terminale cytosolische G-Domäne ist am besten untersucht und ist verantwortlich für die Energieproduktion des Transporters durch GTP-Hydrolyse. Die zweite Domäne fungiert als Verbindungsstück der G-Domäne zur Transmembran-Domäne des Proteins. Dieser Bereich ist vermutlich der eigentliche Transporter für Fe(II).

Es wird angenommen, dass die Transmembran-Domäne eine Pore aus drei hoch konservierten Cysteinen aufbaut. Ein weiteres konserviertes Cystein wurde an der Außenseite der Transmembran-Domäne gefunden. Dieses fungiert vermutlich als Sensor der mit den anderen Domänen kommuniziert, sobald Fe(II) präsent ist.

In diesem Projekt wurde das kürzlich entwickelte Struktur-Modell des vollständigen FeoB Proteins untersucht, sowie dessen Funktionalität als Fe(II)-Transporter.

Mit verschiedenen Methoden wurden die Cysteine der Pore vernetzt um zu überprüfen, ob sie tatsächlich wie angenommen aufgebaut ist. Die Verknüpfung nahe gelegener Cysteine konnte somit gezeigt werden. Weiters wurde die Fähigkeit der Pore sich zu öffnen und zu schließen untersucht. Zu diesem Zweck wurde FeoB mit GTP und Fe(II) inkubiert und mit chemischen Substanzen vernetzt. Die Resultate zeigen, dass die Pore in einem offenen und geschlossenen Zustand vorliegen kann.

Um die Funktionalität als Eisen-Transporter zu untersuchen, wurde FeoB in die Membran eines Lipidvesikels eingebaut und unter der Anwesenheit von GTP und Fe(II) ein annähernd physiologisches Milieu simuliert. Trotz eines erfolgreichen Einbaus konnte kein Transport von Fe(II) nachgewiesen werden.

Ziele dieser Studie waren die Bestätigung des FeoB Struktur-Modells, sowie weitere Untersuchung dessen die Funktionalität. Diese Ziele wurden teilweise erreicht. Die erhaltenen Daten deuten auf die Richtigkeit des Modells hin, die angedachte Funktion des Proteins als Transporter konnte hingegen nicht nach gewiesen werden. Die Ursache dafür, sowie allgemeine weitere Untersuchungen des Proteins sind notwendig, um den Prozess der Fe(II)-Aufnahme vollständig zu verstehen. Dieses Verständnis könnte in weiterer Folge als Basis für verschiedene Behandlungsmöglichkeiten von P. aeruginosa Infektionen dienen.

Zusammenfassung (Englisch)

Pseudomonas aeruginosa is a common bacterium found in many different habitats. It causes diseases in plants and animals, including humans. The pathogen is considered an opportunist as it infects mainly immune-compromised people. The most common diseases are pneumonia in cystic fibrosis patients, tissue infection in burn victims and nosocomial infections.

Infections caused by P. aeruginosa are hard to treat, as the bacteria show a highly intrinsic resistance to antibiotics and other antimicrobial substances. This natural resistance is mainly attributed to low membrane permeability and caused by very efficient drug-efflux-pumps. These pumps reduce the amount of antimicrobial substances to sub-toxic levels within the cell.

As an opportunist P. aeruginosa does not show high pathogenicity. Nevertheless, it shows high virulence, which leads to a high infection potential caused by the colonization and rapid growth within the host. This is featured by many virulence-factors. The most noteworthy is the ability of biofilm production. Besides natural resistance, this ability also leads to difficulties in treatment of infections, as the biofilm acts as a physical barrier against antimicrobial substances and cells of the immune system.

For the production of many of these virulence factors, as well as for many different metabolic pathways, iron is an essential substance. This dependence makes the iron-metabolism of pathogens an attractive target in possible treatments of bacterial infections. The uptake of iron is an especially important target, as its blockage would lead to a malfunction in all following processes dependent on iron resulting in starvation and death of the bacteria.

Iron can be present in two different valence states to which bacterial uptake mechanisms have adapted. Hardly soluble ferric iron is taken up in an iron-siderophore-complex. Siderophores are small molecules with a high affinity for ferric iron. In contrast, ferrous iron is highly soluble and is taken up by either the Feo system or Sit system. In P. aeruginosa only the Feo system is known, highlighting its feature as potential target.

The Feo system consists of three proteins, namely FeoA, FeoB and FeoC. Although the roles of each protein are not completely understood yet, FeoB is known to be the actual permease, which transports iron through the membrane. The natural characteristics of trans-membrane proteins make it hard to study them. Thus, only a few studies on the full length FeoB were conducted.

FeoB is build up by three domains. A N-terminal G-Domain, which hydrolyses GTP and acts as the energy producing compartment of the transporter. The second domain acts as a linker between the G-domain and the C-terminal trans-membrane domain. This domain is supposed to be the permease subunit, acting as the transporter of ferrous iron.

It is believed that this membrane domain builds up a pore of highly conserved cysteines. Another conserved cysteine found on the outside facing side of the protein is supposed to act as an iron sensor, signalling the presence of Fe2+ to the other domain and therefore initiating the iron transport.

This project aimes to test the newly developed structure model of the full length FeoB protein. Also the supposed function as an iron transporter will be investigated.

Different methods where used to crosslink the presumed pore-cysteins, indicating the presence of closely located cysteines. Furthermore, it was tested if the cysteines build up a functional pore, which can be opened and closed. Results of this experiment show a positive outcome, as two different states of the pore could be shown, supposedly an open and a closed state.

To test the function of FeoB as a transporter, the protein was incorporated into the membrane of lipid-vesicles. With the presence of GTP and ferrous iron, the assumed physiological like condition was simulated. Despite a successful incorporation of the protein into the liposomes, no actual transport of iron could be observed.

The aim of this study to support the assumptions of the newly developed structure-model was met, as the results strongly support the accuracy of the model. In contrast, the function of FeoB as an iron transporter could not be shown. Therefore, to fully understand this process additional research has to be done to gain more insight in the mechanism of action. Once the iron transport of the Feo system is fully understood, this knowledge could lead to new developments and strategies for dealing with multi-drug resistant bacteria.

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