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Title
Taken out of context: Context dependency of co-expression vectors for an artificial pathway / Vorgelegt von: Jakob Reiterlehner
Additional Titles
Aus dem Kontext gegriffen: Kontextabhängigkeit von Coexpressionsvektoren für einen künstlichen Pathway
AuthorReiterlehner, Jakob
Thesis advisorRumpel, Klaus
Published2017
Institutional NoteWien, FH Campus Wien, Masterarb., 2017
Annotation
Abweichender Titel laut Übersetzung der Verfasserin/des Verfassers
Date of SubmissionMay 2017
LanguageEnglish
Document typeMaster Thesis
Keywords (DE)genetischer Kontext / Biokatalyse / Biotransformation / Metabolic Engineering
Keywords (EN)genetic context / biocatalysis / biotransformation / metabolic engineering
URNurn:nbn:at:at-fhcw:1-4625 Persistent Identifier (URN)
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Taken out of context: Context dependency of co-expression vectors for an artificial pathway [1.48 mb]
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Abstract (German)

In den letzten zehn Jahren wurde zunehmend an immer komplexeren, auf enzymatischen Kaskaden basierenden Synthesewegen geforscht. In der Biokatalyse brachte die Untersuchung und Etablierung künstlicher Stoffwechselwege in lebenden Zellen enorme Erfolge in der Herstellung hochwertiger Chemikalien. Einige offensichtliche Vorteile von in vivo-Systemen sind der kooperative Effekt von Enzymen mit ihrer inhärenten hohen Chemo-, Regio- und Stereoselektivität, die nicht notwendige Isolierung von Zwischenprodukten und das Recycling von Cofaktoren durch den Wirtsorganismus. Interaktionen von Zwischenprodukten mit dem enzymatischen Wirtshintergrund, sowie die exakte Kontrolle über die heterologe Expression von Proteinen, die gewöhnlich von der Zellmaschinerie mittels Plasmiden synthetisiert werden, stellen Probleme dar, die im Rahmen dieses Projekts berücksichtigt werden müssen. Außerdem ist die metabolische Belastung aus der Produktion von zusätzlichen Enzymen unweigerlich hoch, daher wurde eine Minimierung dieser Belastung durch die Konstruktion von Vektoren für die Co-Expression von Kaskadenenzymen angestrebt.

Die Synthesestrategie für die polyhydroxylierten Zielverbindungen wurde mittels organischer Retrosynthese konzipiert. Diese umfasst eine Alkoholdehydrogenase (ADH; AlkJ), eine Aldolase (FucA), und eine Phosphatase, und soll in E. coli etabliert werden. Ausgehend von primären, aromatischen Alkoholsubstraten werden mittels ADH Aldehyd-Zwischenprodukte hergestellt. Diese sind, zusammen mit zelleigenem Dihydroxyacetonphosphat (DHAP), das Substrat für die Umwandlung in die gewünschten polyhydroxylierten Verbindungen. Mit der Hilfe von sequenz- und ligationsunabhängigen Klonierungsstrategien (SLIC) konnte der neue Stoffwechselweg in E.coli etabliert werden. Mittels unterschiedlicher Vektoren (pKA1_fucA:alkJ und pKA1_alkJ:fucA) wurden dann Expressions- und Aktivitätsstudien erfolgreich mit resting cells und zwei strukturell unterschiedlichen Substraten (2-Phenylethanol und 2-(Benzyloxy)ethanol) durchgeführt.

Abstract (English)

In the past decade, synthetic routes with increasing complexity have been designed via enzymatic cascade reactions. Tremendous success was achieved in the field of biocatalysis by the investigation and establishment of artificial metabolic pathways for the production of high value chemicals in living cells. Apparent advantages of in vivo approaches are the cooperative effect of multiple biocatalysts with their inherently high chemo-, regio- and stereoselectivity, the recycling of cofactors by the host and the omission of intermediate isolation. However, interference of the hosts enzymatic background with de novo cascades and tight control over the amounts of pathway components, which are usually synthesized from plasmids by the cellular machinery, are bottlenecks to be tackled. Since the metabolic burden by the production of synthetic pathway elements is inevitably high, this thesis aims at the reduction of plasmid burden by construction of vectors for co-expression of pathway enzymes and, consequently, minimizing the drain of cellular resources from the host.

The desired synthetic pathway was designed via retrosynthesis from target polyhydroxylated compounds, comprises of an alcohol dehydrogenase (ADH; AlkJ), an aldolase (FucA), and a phosphatase, and was introduced in E. coli. Starting from primary aromatic alcohols, the artificial pathway produces aldehyde intermediates, which are converted, together with dihydroxyacetone phosphate (DHAP) from the central carbon metabolism of the host, into the target polyhydroxylated compounds. Pathway assembly was enabled by sequence- and ligation-independent cloning (SLIC) techniques. Vectors pKA1_fucA:alkJ and pKA1_alkJ:fucA were constructed and correct assembly was checked by Sanger sequencing. The new genetic systems were characterized by enzyme expression studies and biotransformation assays in resting cells (RCs) monitoring AlkJ activity with the two structurally different substrates 2-phenyl ethanol and 2-(benzyloxy) ethanol.

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