Titelaufnahme

Titel
Evaluation of Proximity Ligation Assay in Neurodegenerative Diseases / Vorgelegt von: Carmen Schwaiger
Weitere Titel
Evaluierung des Proximity Ligation Assays in Neurodegenerative Erkrankungen
AutorInnenSchwaiger, Carmen
GutachterSwoboda, Ines
Erschienen2017
HochschulschriftWien, FH Campus Wien, Masterarb., 2017
Anmerkung
Abweichender Titel laut Übersetzung der Verfasserin/des Verfassers
Datum der AbgabeOktober 2017
SpracheDeutsch
DokumenttypMasterarbeit
Schlagwörter (DE)Neurodegenerative Erkrankungen / Protein-Protein Co-Lokalisierung / Protein-Protein Interaction / Proximity Ligation Assay / Human-Gewebe basierend
Schlagwörter (EN)Neurodegenerative diseases / protein-protein co-localization / protein-protein interaction / proximity ligation assay / human tissue-based
URNurn:nbn:at:at-fhcw:1-4677 Persistent Identifier (URN)
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Evaluation of Proximity Ligation Assay in Neurodegenerative Diseases [19.22 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

In den letzten Jahrzehnten erhöhte sich weltweit die Lebenserwartung der Bevölkerung. Mit fortschreitendem Alter steigt die Inzidenz vieler Erkrankungen inklusive neurodegenerativer Erkrankungen wie Morbus Parkinson (PD) und Morbus Alzheimer (AD).

Neurodegenerative Erkrankungen (NDDs) kennzeichnen sich durch einen Verlust von Neuronen und die Akkumulation verschiedener physiologischer, jedoch posttranslational modifizierter Proteine aus. Allgemein werden diese Krankheiten durch die Akkumulation eines einzelnen Proteins beschrieben. Allerdings zeigten mehrere Studien ko-lokalisierte Akkumulationen von mehr als nur einem neuropathologischen Protein in derselben pathologischen Struktur. Eine endgültige Diagnose von NDDs kann erst nach dem Tod gestellt werden, wodurch die Aufklärung der zugrundeliegenden Pathomechanismen verhindert wird.

Wir verglichen konfokale Immunfluoreszenz-Laser-Scanning-Mikroskopie (LSM) mit dem neuartigen Proximity Ligation Assays (PLA) in histologischen Schnitten von Hirngewebe von Patienten mit verschiedenen NDDs mit mehr als einem pathologischen Protein in den jeweiligen Proteinablagerungen (gemischte Proteinopathien). In weiterer Folge wurden die Ergebnisse mit Fluoreszenz- (Förster-) Resonanz-Energieübertragung (FRET) validiert.

In der LSM-Analyse stellte sich heraus, dass die Lasereinstellungen die Anzahl der Protein-Ko-Lokalisierungen signifikant beeinflussen kann. Die PLA-Auswertung zeigte ein größeres Maß an Protein-Protein-Ko-Lokalisierung in menschlichen Hirngewebeabschnitten verschiedener NDDs als der Goldstandard FRET.

Wir stellten fest, dass die Verwendung des PLA eine schnelle und bequeme Anwendung darstellt, aber nicht für die Bewertung der Protein-Protein-Ko-Lokalisierung in Fällen von NDDs verwendbar ist. PLA erlaubt keine ausreichende Aussage über Protein-Protein-Ko-Lokalisierungen, da keine weitere Bestimmung des exakten Abstandes unter 40nm erfolgen kann. Zusätzlich ist die Anwendung des PLA auf Gewebeschnitten im Vergleich zu einzelnen Zellen sehr teuer. Für die Ko-Lokalisierung und Interaktionsanalyse ist der PLA nicht geeignet, um FRET, inklusive spezialisierter mathematischer Makroanalyse, als Goldstandard zu ersetzen.

Zusammenfassung (Englisch)

Over recent decades life expectancy of the human population increased all around the world. With progressing age the incidence of many diseases like cancer, cardiovascular diseases, and neurodegenerative diseases such as Parkinson disease (PD) and Alzheimer disease (AD) increases.

Neurodegenerative diseases (NDDs) are characterized by loss of neurons and accumulation of various physiologically occurring proteins with posttranslational modifications. While typically diseases are described by the accumulation of the respective protein causing the disease, several studies showed co-localizations with at least one more protein in pathologic regions. A definitive diagnosis of NDDs can only be obtained post mortem impeding elucidation of underlying pathomechanisms.

To allow evaluation of potential interaction of proteins associated with various NDDs in the same brain (i.e. mixed proteinopathies), we tested the application of the novel proximity ligation assay (PLA) in comparison with confocal immunofluorescence laser scanning microscopy (LSM). To elucidate mere co-localization, we additionally validated our data with Fluorescence (Förster) resonance energy transfer (FRET).

LSM analysis revealed that laser settings significantly influence interpretation of the number of identified protein-protein co-localizations. PLA detects more protein-protein co-localization in human brain tissue sections of various NDDs compared to the gold standard FRET.

We concluded that the use of PLA is a fast and convenient application but not suitable for evaluation of protein-protein co-localization and protein-protein interaction in cases of NDD. PLA identifies protein-protein proximities of up to 40nm with no further discrimination of co-localization/interaction below 40nm. In comparison FRET analysis can measure protein-protein proximities with a cut-off of 10nm. Also, the use of PLA on tissue sections is associated with high costs.

For co-localization and interaction analysis PLA is not suitable to replace FRET with specialized mathematical macro-analysis as gold standard.

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