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Title
Genetische Charakterisierung des Calcium-sensing Rezeptors (CASR) in colorectalen Krebszellen und stabile Transfektion einer colorectalen Krebszelle mit dem CASR. / vorgelegt von: Rebecca Maria Grüneis
Additional Titles
Genetic characterization of the calcium-sensing receptor (CASR) in colorectal cancer cells and stable transfection of a colorectal cancer cell line with CASR.
AuthorGrüneis, Rebecca Maria
Published2017
DescriptionVI, 72 Blatt
Institutional NoteWien, FH Campus Wien, Masterarb., 2017
Date of SubmissionAugust 2017
LanguageEnglish
Document typeMaster Thesis
Keywords (DE)CaSR / Colorectales Karzinom / DNA Sequenzierung / Transfektion / Lipofectamine
Keywords (EN)CaSR / Colorectal Cancer / DNA sequencing / Transfection / Lipofectamine
Keywords (GND)Calcium / Epithelkörperchen
URNurn:nbn:at:at-fhcw:1-4945 Persistent Identifier (URN)
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Genetische Charakterisierung des Calcium-sensing Rezeptors (CASR) in colorectalen Krebszellen und stabile Transfektion einer colorectalen Krebszelle mit dem CASR. [2.61 mb]
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Abstract (German)

Der Calcium-sensing receptor (CaSR) ist ein G-Protein gekoppelter Rezeptor und ist primär in der Nebenschilddrüse exprimiert. Die Hauptaufgabe des Rezeptors ist die Regulierung des Calciumhaushalts. Weiters ist dieser jedoch auch in unterschiedliche physiologische als auch pathophysiologische Bedingungen wie Hormonsekretion, Proliferation und Differenzierung involviert.

Ziel dieser Masterarbeit ist es das CASR Gen in Zelllinien des Colorectalcarcinoms genetisch zu charakterisieren und eine stabil transfizierte Zelllinie mit einer CaSR Überexpression zu erstellen. Die Hypothese hierfür ist, dass der CaSR ein Tumorsuppressor ist und Überexpression des CaSR in transfizierten Zellen zu verminderter Proliferation und erhöhter Differenzierung als auch Apoptose führt.

Mittels DNA Sequenzierung wurden sieben colorectale Zelllinien auf Mutationen im CASR Gen überprüft und detektierte Varianten anhand der Datenbank Alamut® Visual analysiert, um Informationen über die möglichen Auswirkungen der Varianten auf die Aktivität des CaSR zu erhalten. Die Transfektion wurde mit zwei unterschiedlichen Plasmiden (cDNA3.1/kan(+)-FLAG-CaSR-EGFP und cDNA3.1/kan(+)-FLAG-EGFP) an den Zelllinien HT-29 und SW-480 mittels LipofectamineTM LTX 3000 durchgeführt. Zur weiterführenden Untersuchung der transfizierten Zellen wurde der MAPK Phosphorylation Antibody Array durchgeführt.

Zehn Genvarianten wurden detektiert, davon sieben Polymoprhismen und drei Mutationen. Drei dieser Polymorphismen führen zu Missense-Substitutionen im codierenden Bereich und vier Polymorphismen liegen im nicht-codierenden Bereich des Gens. Mutationen wurden nur in der Zelllinie DLD-1 gefunden. Dabei geht die Anzahl der Mutationen mit der Passagennummer einher. Die stabile als auch die transiente Transfektion der Zelllinie HT-29 waren nicht erfolgreich. So wurde alternativ die Zelllinie SW-480 transient transfiziert Der MAPK Phsophorylation Antibody Array an transfizierten SW-480 Zellen zeigte eine geringe Auswirkung der Behandlung mit Kalzium

Um die Bedeutung von Mutationen des CASR Gens in colorectalem Karzinom zu verstehen, sind noch weitere Untersuchungen notwendig. Als weiterführendes Experiment ist eine stabile Transfektion an der Zelllinie SW-480 inklusive in vitro und in vivo Experimenten geplant.

Abstract (English)

The calcium sensing receptor (CaSR) is a G protein-coupled receptor and is mainly expressed in the parathyroid gland. Its central role is the regulation of calcium homeostasis but it also regulates other processes, as hormone secretion, proliferation, differentiation. In cancer it can act either as an oncogene or as a tumour suppressor depending on the tissue.

The aim of this master thesis is to genetically characterise the CASR in CRC cell lines and to establish a stable transfected CRC cell line overexpressing CaSR. The hypothesis is that the CaSR is an oncogene and its overexpression leads to decreased proliferation and increased differentiation and apoptosis, by regulating phosphorylation of signalling molecules in the transfected cells.

We analysed seven CRC cell lines by DNA sequencing using specific primers for the CASR. Detected CASR variants were analysed with the mutation software Alamut® Visual and compared to the literature to obtain information about the potential effect of the variant on the activity of the CaSR. The transfection was performed on HT-29 and SW-480 cells using LipofectamineTM LTX 3000 and two different plasmids: cDNA3.1/kan(+)-FLAG-CaSR-EGFP and cDNA3.1/kan(+)-FLAG-EGFP. As a functional assay the MAPK Phosphorylation Antibody Array was performed.

Ten variants were detected: seven polymorphisms and three mutations. Three polymorphisms cause missense substitutions in the coding region and four polymorphisms were in the non-coding region of the gene. The variants leading to mutant proteins were found only in the DLD-1 cell line. Stable as well as transient transfection of HT-29 cells did not work. Alternatively SW-480 cells were transiently transfected. The MAPK Phosphorylation Antibody Array showed only a minor effect of the treatment with calcium.

To understand the significance of CaSR mutants in colorectal tumorigenesis further investigations are needed. As a future experiment a stable transfection on SW-480 cells as well as in vitro and afterwards in vivo studies with those will be performed.

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