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Title
Validierung prä-analytischer Parameter zur Implementierung zellfreier Tumor DNA als zuverlässige minimal-invasive diagnostische Resource / vorgelegt von: Lisa Saloberger-Sindhöringer
Additional Titles
Validation of pre-analytical parameters to introduce cell-free tumor DNA as reliable minimal-invasive diagnostic tool
AuthorSaloberger-Sindhöringer, Lisa
Published2017
DescriptionIX, 78 Blatt
Institutional NoteWien, FH Campus Wien, Masterarb., 2017
Date of SubmissionAugust 2017
LanguageGerman
Document typeMaster Thesis
Keywords (DE)Neuroblastom / zellfreie DNA / Flüssigbiopsie / Heterogenität / Plasma / Serum / Streck / Pax / Roche / Paxgene / EDTA / heparin
Keywords (EN)Neuroblastoma / ctDNA / cfDNA / heterogeneity / liquid biopsy / plasma / serum / Streck / Paxgene / EDTA / heparin / Roche
Keywords (GND)Neuroblastom
URNurn:nbn:at:at-fhcw:1-4963 Persistent Identifier (URN)
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Validierung prä-analytischer Parameter zur Implementierung zellfreier Tumor DNA als zuverlässige minimal-invasive diagnostische Resource [7.72 mb]
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Abstract (German)

Das Neuroblastom ist eine der häufigsten soliden Krebserkrankungen bei Kindern und für rund 15 Prozent der onkologisch-pädiatrischen Todesfälle verantwortlich. Diese Tumorart ist durch eine ausgeprägte genetische und klinische Heterogenität gekennzeichnet, welche eine Diagnose und therapeutische Entscheidungen schwierig macht. Die Analyse zirkulierender Tumor DNA kann als zusätzliche minimal-invasive Methode für eine effizientere DNA Diagnose und eine engmaschigere Überwachung von Krankheitsverläufen genutzt werden.

Aufgrund von Inkonsistenzen beziehungsweise Differenzen bezüglich Probenvorbereitungsprotokollen, zielte diese Studie darauf ab, analytische und prä- analytische Verfahren zu untersuchen und zu beschreiben. Des Weiteren wurden verschiedene Methoden der DNA-Isolierung und optimaler Verarbeitung von zellfreier DNA zur SOP-Reife ausgewertet, um die Möglichkeit zu schaffen die `Flüssigbiopsie in die klinische Routine zu implementieren. Um dies zu ermöglichen, wurden diverse Parameter, wie die Auswahl der optimalen Blutentnahmeröhrchen, Probenstabilität über einen definierten Zeitraum und Einfluss der Lagerungstemperatur, auf die Qualität und Quantität der isolierten zellfreien-DNA im Blutplasma, Knochenmarksplasma und Serum untersucht.

Die Menge an zirkulierender DNA wurde in Plasma- und Serumproben des selben Patienten untersucht. In allen Serumproben waren höhere Konzentrationen an zellfreier DNA und deutlichere DNA-Fragmente von rund 166bp zu finden als in Plasma DNA. Die Ergebnisse zeigten auch, dass EDTA-Röhrchen für die Gewinnung von Plasma innerhalb von 4 Stunden nach Blutabnahme geeignet sind und die Lagertemperatur keinen signifikanten Einfluss auf die Konzentration zellfreier DNA hat. Bei Lagerung auf Raumtemperatur kam es in den EDTA-Röhrchen dennoch zu einem Anstieg der Plasma- DNA. Die in zell-stabilisierenden Blutröhrchen entnommenen Blutproben zeigten keine Anzeichen einer Zelllyse und somit Freisetzung genomischer DNA. In den Heparinröhrchen hingegen konnten wir bereits nach 4 Stunden einen signifikanten Anstieg der zellfreien DNA, besonders hochmolekularer DNA, feststellen. In Standard- Serumröhrchen gesammelten und nach unterschiedlichen Zeitpunkten abzentrifugierten Blutproben zeigen einen größeren Anstieg der zellfreien DNA-Konzentration nach 48h bei Lagerung auf RT verglichen zu 4C. Im Gegensatz dazu können spezielle Serum- Gelröhrchen für die Stabilisierung von Vollblut bei 4C über einen Zeitraum von 48 Stunden empfohlen werden.

III

Speziell entwickelte Konservierungsröhrchen verhindern eine Kontamination genomischer DNA und ermöglichen eine Stabilisierung des Blutes während des Transportes. Wenn der Versand jedoch nicht notwendig ist und Blut innerhalb von 24 Stunden bei einer Lagertemperatur von 4 C verarbeitet werden kann, bieten die EDTA- Röhrchen ein adäquates und kostengünstiges Antikoagulans zur Gewinnung von Plasma im Vergleich zu neuartigen Stabilisatoren.

Abstract (English)

Neuroblastoma (NB) is the most common extra-cranial solid tumor of infancy and is responsible for about 15% of cancer related pediatric deaths. This tumor type is characterized by a remarkable biological and clinical heterogeneity, which, to a large extend, is manifested in certain genomic aberrations. However, intratumor heterogeneity makes diagnostic approaches and therapeutic decisions challenging. Circulating tumor DNA (ctDNA) could perhaps serve as an additional, minimal-invasive source for tumor DNA diagnostics and disease monitoring.

Due to a lack of consistency between different protocols for sample processing, this study aimed to harmonize pre-analytical and analytical procedures and to validate different techniques of sample handling and DNA-isolation of cell-free DNA (cfDNA) in order to provide clear guidelines and standards (generate SOPs) for implementing liquid biopsy in the clinical routine. The various effects of sample conditions, - such as selection of the optimal blood collection tube, sample stability over time, and influence of storage- temperature - on the quality of the isolated cfDNA from peripheral blood plasma, bone marrow plasma and serum, were investigated.

We found significant differences between paired plasma and serum samples in the total amount of cfDNA and a more prominent peak at 166bp in the serum samples than in the plasma samples. Our results showed that the amount of cfDNA from plasma collected in EDTA tubes remained stable for up to 4h, and during this period of time there was no influence of storage temperature on the cfDNA concentrations. However, after 4h at RT an increase of total amount of cfDNA was noted. Collection of whole blood in commercially available cell-stabilizing test tubes did not show evidence of cell lysis up to 48h, whereas the heparin tubes showed a significant increase in cfDNA levels and high molecular weight DNA, already after 4h. Collection of whole blood in standard serum tubes and centrifugation at certain time-points until 48h showed a higher increase in cfDNA concentrations in samples stored at RT compared to 4C. In contrast, the amount of cfDNA did not change over a time-period of 48h at 4C, when blood was collected in special serum gel tubes.

The commercially available preservative tubes seemed to be equally useful in preventing genomic DNA contamination by disruption of white blood cells during sample storage. When shipping is not necessary and blood can be processed within 24h and stored at 4C, the EDTA tubes provide a valid and cost-effective anticoagulant for plasma samples compared to commercially available cfDNA tubes.

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