Titelaufnahme

Titel
The characterization of necroptotic cells and their role in inflammation / Vorgelegt von: Peter Stoll
Weitere Titel
Die Charakterisierung von nekroptotischen Zellen und ihre Rolle in der Entzündungsreaktion
AutorInnenStoll, Peter
GutachterSwoboda, Ines ; Öhler, Rudolf
Erschienen2018
HochschulschriftWien, FH Campus Wien, Masterarb., 2018
Anmerkung
Abweichender Titel laut Übersetzung der Verfasserin/des Verfassers
Datum der AbgabeOktober 2018
SpracheEnglisch
DokumenttypMasterarbeit
Schlagwörter (DE)Apoptose / Nekroptose / RIPK1 / Immunogenität / pMLKL / TNF-alpha / TRAIL / IL-8
Schlagwörter (EN)apoptosis / necroptosis / RIPK1 / immunogenicity / pMLKL / TNF-alpha / TRAIL / IL-8
URNurn:nbn:at:at-fhcw:1-4789 Persistent Identifier (URN)
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The characterization of necroptotic cells and their role in inflammation [2.03 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Der Begriff Nekroptose erklärt einen regulierten Zelltod, welcher verschiedene Ähnlichkeiten sowohl mit Apoptose, als auch mit Nekrose aufweist. Während Nekroptose durch potentielle Auslöser von Apoptose induziert werden kann, verläuft der Prozess des Zelltodes unabhängig von Caspasen und endet mit spezifischen morphologischen Merkmalen. Die Stimulation von veschiedenen Rezeptoren wie TNFR 1, FAS-ligand/TRAIL Rezeptor oder TLR4 unter der Bedingung, dass Caspasen unterdrückt werden, führt zu Formation eines Komplexe bestehend aus RIPK1, RIPK3 und MLKL. Dies resultiert in einer Nekroptose Signalkaskade. Die Ziele dieser Studie waren die Etablierung eines nekroptotischen Zellmodels, sowie die Untersuchung von ausgeschütteten Cytokinen von Immunzellen, wenn diese zusammen mit nekroptotischen Zellen kultiviert werden. Diese Untersuchung wurde durchgeführt um zu prüfen ob Nekroptose immunogener als Apoptose auf das Immunsystem wirkt.

Zunächst fokussierten wir uns auf die Etablierung eines nekroptotischen Zellmodels, indem wir verschieden Tumorzelllinien und potentielle Auslöser für Nekroptose testeten. Der Effekt von diesen Auslösern auf diverse Tumorzelllinien wurde zunächst mit Hilfe eines Metabolischen-Aktivitäts Assay (EZ4U) und in weiterer Folge genauer mit Hilfe von Durchflusszytometrie analysiert. Weiters wurden die behandelten Zellen über längere Zeit unter einem Mikroskop beobachtet und so über ihre morphologischen Eigenschaften charakterisiert. Der molekulare Marker von Nekroptose, pMLKL, wurde mittels Western Blot und Immunhistochemie dargestellt. Im letzten Teil wurde mittels ELISA und FlowCytomix die Freisetzung von Zytokinen von Immunzellen gemessen, die mit nekroptotischen Zellen co-kultiviert wurden.

Durch Durchflusszytometrie und Mikroskopie wurde herausgefunden, dass U937, welche mit TRAIL oder TNF- zusammen mit einem pan-caspase Inhibitor zVAD behandelt wurden, vielversprechend für ein Nekroptose Modell sind. Der am besten etablierte Nekroptose Marker pMLKL konnte mittels Western Blot und Immunhistochemie dargestellt werden. Elisa und FlowCytomix Analysen ergaben, dass es keinen großen Unterschied ergibt, ob Tumorzellen mit TNF- oder mit TNF + zVAD behandelt werden, jedoch dass mehr IL-8 und TNF- bei nekroptotischen Zellen ausgeschüttet wurde, im Vergleich zu mit UV-C oder Hitze behandelten U937. Während die Etablierung des nekroptotischen Zellmodels erfolgreich war, bleibt die Frage nach der höhern Immunogenität von Nekroptose gegenüber Apoptose teils noch ungeklärt.

Zusammenfassung (Englisch)

The term necroptosis describes a regulated type of cell death, which has various similarities with apoptosis and necrosis. While necroptosis can be induced through potential apoptosis inducers, the course of cell death is caspase independent and results in distinct morphological features. Triggering various receptors like TNFR I, FAS-ligand/TRAIL receptor or TLR4 under caspase-compromised conditions leads to complex formation of RIPK1, RIPK3 and MLKL and results in necroptosis signaling. The aims of this study were to establish a necroptotic model and to examine the release of cytokines from immune cells when co-cultivated with necroptotic cells to prove whether or not necroptosis is a more immunogenic process than apoptosis. Therefore, we first focused on establishing a necroptosis model, using different tumor cell lines and necroptosis inducers. The effect of potential necroptotic inducers on tumor cells was analysed via a metabolic activity assay (EZ4U) in the first step and then more closely looked at by flow cytometry staining with active Caspase-3 and Zombie. Second, necroptotic cells were further characterized through their morphological features, which differ greatly from apoptotic cells, using microscope imaging, as well as by detection of pseudokinase MLKL via immunohistochemistry and Western Blot. Third, the release of cytokines from immune cells co-cultivated with necroptotic cells was investigated via ELISA and FlowCytomix. Flow cytometer measurements and microscopic evaluation identified U937 treated with TRAIL or TNF- in combination with the pan-caspase inhibitor zVAD as the most promising necroptosis model. pMLKL, as the most established necroptosis marker, could be observed via Western Blot and immunohistochemistry. ELISA and FlowCytomix analysis of supernatants from co-cultures of PBMCs and differently treated tumor cells revealed no difference between TNF- and TNF- + zVAD in terms of IL-8 release. However, IL8 and TNF- concentrations were higher in co-cultures with necroptotic cells compared to co-cultures with UV-C treated apoptotic cells or heat-treated necrotic cells. While the establishment of a necroptosis model was successful, the question if necroptosis is more immunogenic than apoptosis remains not completely answered.

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