Titelaufnahme

Titel
Tissue-specific mapping of the NSun6-mediated RNA methylome using miCLIP and RNA-BisSeq in Drosophila melanogaster / Vorgelegt von: Cynthia Wollner
Weitere Titel
Gewebe-spezifische Kartierung des NSun6-vermittelten RNA Methylomes mittels miCLIP and RNA-BisSeq in Drosophila melanogaster
AutorInnenWollner, Cynthia
GutachterWank, Herbert
Erschienen2018
HochschulschriftWien, FH Campus Wien, Masterarb., 2018
Anmerkung
Abweichender Titel laut Übersetzung der Verfasserin/des Verfassers
Datum der AbgabeOktober 2018
SpracheEnglisch
DokumenttypMasterarbeit
Schlagwörter (DE)RNA Modifizierungen / (Cytosin-5) RNA Methyltransferasen / NSun6 / miCLIP / RNA-BisSeq
Schlagwörter (EN)RNA modifications / (Cytosine-5) RNA methyltransferases / NSun6 / miCLIP / RNA-BisSeq
URNurn:nbn:at:at-fhcw:1-4805 Persistent Identifier (URN)
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Tissue-specific mapping of the NSun6-mediated RNA methylome using miCLIP and RNA-BisSeq in Drosophila melanogaster [2.55 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

NSun6 ist eine (Cytosin-5) RNA-Methyltransferase, die zwei tRNAs in humaner Zellkultur methyliert, aber ihr vollständiges RNA-Substratspektrum ist unbekannt. In dieser Studie wurde das NSun6-Enzym von Drosophila melanogaster untersucht.

Um die Gewebe zu identifizieren, in denen NSun6 wichtig sein könnte, wurde eine qRT-PCR-Analyse durchgeführt. NSun6-mRNA war verbreitet, aber im Allgemeinen niedrig exprimiert. Jedoch wurde eine relativ höhere Expression in der weiblichen Keimbahn und in einem frühen Stadium der Embryogenese nachgewiesen. Interessanterweise prognostizierte die Genom-Annotation eine lange nicht-kodierende RNA (lncRNA) auf dem Antisense-Strang genau dort, wo NSun6 im Genom kodiert ist. In der Tat zeigte eine Strang-spezifische qRT-PCR, dass die Expression dieser lncRNA mit der Expression von NSun6-mRNA invers korreliert, was darauf hindeutet, dass diese lncRNA eventuell die Expression von NSun6 über RNA Interferenz reguliert werden könnte.

Darüber hinaus ergab die Überexpression von NSun6 Daten, die darauf hinweisen, dass NSun6 ein zytoplasmatisches Protein ist. Unter Verwendung einer katalytisch mutanten Form von NSun6, die ihre Substrate während der Methylierungsreaktion zwar bindet aber nicht mehr freisetzen kann, wurde ein Protokoll erstellt, um das Substratspektrum von NSun6 zu adressieren. RNAs wurden aus NSun6-RNA-Komplexen isoliert und verschiedene Methoden zur Etablierung von Sequenzierungsbibliotheken für das Next-Generation-Sequencing wurden getestet.

Eine der RNAs, die mit NSun6 assoziierte, ist tRNA-Cystein. In Folge wurde RNA-Bisulfit-Sequenzierung durchgeführt, und die Ergebnisse zeigen, dass tRNA-Cystein an Position 72 methyliert ist, wie zuvor auch in menschliche Zellen gezeigt werden konnte. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass tRNA-Methylierung an dieser Position zwischen Menschen und Drosophila melanogaster konserviert ist.

Zusammenfassung (Englisch)

NSun6 is a (cytosine-5) RNA methyltransferase that methylates two tRNAs in human cell culture but its full RNA substrate spectrum is unknown. In this study, the NSun6 enzyme of Drosophila melanogaster was investigated.

To identify the tissues in which NSun6 might be important, qRT-PCR analysis was performed. NSun6 mRNA was widely but generally lowly expressed. However, relatively high expression was detected in the female germ line and in early stages of embryogenesis. Interestingly, genome annotation predicted a long non-coding RNA (lncRNA) on the antisense strand exactly at the gene locus of NSun6. Indeed, strand-specific qRT-PCR showed that the expression of this lncRNA is inversely correlated with the expression of NSun6 mRNA suggesting this lncRNA regulates NSun6 expression via small RNA interference pathways.

Furthermore, ectopic NSun6 expression revealed that NSun6 is a cytoplasmic protein. Using a catalytic mutant form of NSun6 that is unable to release its substrates during the methylation reaction, a protocol was established to address the substrate spectrum of NSun6. RNAs were isolated from NSun6-RNA complexes and various methods for the establishment of sequencing libraries were tested before Next Generation Sequencing.

One of the RNAs that were found to be associated with Drosophila NSun6 was tRNA-Cysteine indicating that this tRNA is a methylation substrate. To validate the m5C methylation in tRNA-Cysteine, RNA bisulfite sequencing was performed. This showed that tRNA-Cysteine was methylated at position 49 and position 72. Since position 49 is methylated by another (cytosine-5) RNA methyltransferase (NSun2), the methylation at position 72 is likely to be due to the activity of NSun6 as was shown previously in human cells. These results indicated that tRNA methylation at this position is conserved between humans and Drosophila melanogaster.

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